鼠李糖乳杆菌对全株玉米青贮品质及瘤胃降解率的影响

2019-07-17张立阳赵洪波张永根

中国畜牧杂志 2019年7期

刘帅，郑健，姜鑫，张立阳，赵洪波，张永根*

（1.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.东北农业大学实验实习与示范中心，黑龙江哈尔滨 150030）

随着我国畜牧业发展水平的提高，全株玉米青贮因其营养价值高、适口性好和易保存等优点在反刍动物饲料供应中占有非常重要的地位，对“节粮型”畜牧业发展起到积极的推动作用[1]。然而，很多地区运用常规发酵方法对全株玉米进行发酵，其表面附着乳酸菌数量不足，不能有效缩短青贮过程中有氧呼吸阶段，造成腐败微生物滋生，营养成分消耗严重，导致青贮品质下降和饲料资源浪费。

目前，国内外主要利用各种微生物制剂提高玉米青贮的发酵特性和营养品质，其中乳酸菌作为最为安全有效的添加剂常被应用于各类青贮饲料发酵。作为青贮添加剂的优良乳酸菌必须具有较强的附着能力和生长能力[2]。鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）作为乳酸菌的一种，最早由Goldin 等从健康人的肠道中分离而得到1 株革兰式阳性菌[3]。LGG 对胃酸和胆汁具有较强耐受性和对肠道黏膜有较强亲和性而被作为益生菌使用[4]。LGG 具有强大的粘附性能，可以清除体内病原体粘附，以及产生对食源性病原体拮抗的物质[5]。此外，刘玉婷等[6]研究发现，LGG 能够利用甘薯废渣产生大量乳酸。目前有关利用LGG 发酵青贮饲料的研究鲜有报道。为此，本试验采用LGG 作为发酵菌剂，探究其对全株玉米青贮品质及瘤胃降解率的影响，以期为LGG 的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料全株玉米选用黑龙江省安达市当地青贮玉米龙辐单208 号，采用青贮收割机收刈乳熟初期和腊熟末期的全株玉米（按照玉米乳线超过2/3 时），切碎至1.5 cm 左右长度。LGG 购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），编号CICC 6141。菌株的活化和培养使用乳酸菌培养基（MRS）进行，配方：酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，Tween 80 1.0g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.05 g，CaCO320.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 6.8，菌株活化后以2%接种量接种于MRS 培养基中，于37℃、200 r/min 条件下扩大培养36 h，收集菌体并调整浓度≥109CFU/mL，备用。

1.2 试验设计采用单因素试验设计，设对照组（CON）和试验组（LGG），分别对新鲜收获全株玉米进行无处理和添加105CFU/g 鲜重的LGG 处理，压实装入聚乙烯袋（35 cm×45 cm），每袋约2 kg，每个处理3 个重复，压实后抽真空封口，25℃左右贮藏。于0、24、36、48 d采集样品，用于后续指标测定。原料及青贮后样品采集参照《饲料采样》（GB/T 14699.1-2005）进行[7]。

1.3 常规营养指标测定干物质（DM）、粗灰分（Ash）、粗蛋白质（CP）、粗脂肪（EE）等常规营养含量按照AOAC 方法[8]进行分析；中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量依照Van Soest 分析体系中提供的方法采用纤维分析仪（美国ANKOM Fiber Analyzer）进行测定[9]；淀粉含量利用淀粉总量检测试剂盒（爱尔兰 Megazyme K-TSTA）进行测定。

1.4 发酵指标测定 pH 采用Sartorius PB-10 型酸度计（赛多利斯科学仪器北京有限公司）测定；乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA）含量采用气相色谱法（岛津GC-2010）测定[10]；氨态氮（NH3-N）采用苯酚-次氯酸钠比色法测定[11]；乳酸（LA）采用高效液相色谱法（Waters-600）测定[12]。本试验青贮综合品质评定依照青贮饲料评定标准（试行）[13]，将有机酸和NH3-N 结合，规定两者各占50%，然后将有机酸得点除以2 与NH3-N 得点相加，进而得出综合得点。综合得点与质量评价表显示，0～20 为极差，20～40 为差，40～60 为一般，60～80 为良好，80～100 为优质。

1.5 试验动物及饲养管理选取3 头安装永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛，体重（600±20）kg。每日饲喂2 次（07:00和18:00），自由饮水。基础日粮为全混合日粮（TMR），按照《奶牛营养需要》[14]配制。日粮组成及营养成分见表1。

1.6 瘤胃降解特性测定将发酵48 d 的全株玉米青贮样品取出，65℃烘48 h，称取7 g 粉碎经1 mm 筛的全株玉米青贮风干样品，放入孔径为50 μm，长×宽为12 cm ×8 cm 的尼龙袋内，袋口用尼龙绳绑好，每4 个袋绑在一根半软塑料管上，并用尼龙绳扎好。每头牛每个时间点设置2 个平行。晨饲前投入奶牛瘤胃中，分别于体内培养24、36、48 h 后取出，在自来水下细流冲洗，直至尼龙袋中流出的水清澈明亮、无味为止。65℃烘干至恒重，称重并记录。装入双层密封袋保存，进行营养成分分析。瘤胃降解参数计算模型[15]及有效降解率（ED）计算公式如下：

表1 日粮组成及营养成分（DM 基础）

式中，p 为在t 培养时间某一营养物质的降解率，a 为快速可降解部分；b 为慢速可降解部分；c 为慢速降解部分降解的速率常数；t 为培养时间点。

式中，a、b、c 同上，k 为待测饲料的瘤胃流通速度（h-1），k 取0.025 h-1[16]。

1.7 统计分析数据使用Excel 2010 进行整理，采用SAS 9.2 统计软件中的ANOVA 过程进行单因素方差分析，平均值的多重比较采用Duncan's 法进行，P＜0.05为差异显著，结果用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 LGG 对全株玉米青贮常规营养价值的影响如表2所示，随着发酵时间的延长，2 组DM 含量均呈下降趋势，48 d 时LGG 组显著高于CON 组。36 d 后LGG 组NDF 和ADF 显著低于CON 组。与CON 组相比，LGG组CP 含量在48 d 时显著高于CON 组。2 组淀粉含量均下降，36 d 后LGG 组显著高于CON 组。青贮过程中EE 含量较低，处理间差异不显著。

2.2 LGG 对全株玉米青贮发酵品质影响如表3 所示，LGG 组各采样时间的pH 均显著低于CON 组，NH3-N含量呈上升趋势，2 组间差异不显著。如表4 所示，2 组LA 含量均呈上升趋势，36 d 后LGG 组显著高于CON 组；AA 和PA 含量较低，24 d 时LGG 组显著高于CON 组。本试验无BA 产生。CON 组综合品质得点为59.5，为一般青贮品质。LGG 组综合品质得点为68，为良好青贮品质。

表2 全株玉米青贮的常规营养价值（风干基础） %

表3 全株玉米青贮的pH 和NH3-N 含量

表4 全株玉米青贮的有机酸含量 %

2.3 LGG 对全株玉米青贮瘤胃降解特性影响

2.3.1 LGG 对全株玉米瘤胃降解率影响如图1 所示，随着瘤胃培养时间的延长，DM、CP 和NDF 在奶牛瘤胃中的降解率均快速增加。LGG 组DM 瘤胃降解率在各时间点始终高于对照组，且在8、24、36、48、72 h差异显著。可能是由于在青贮过程中添加LGG，改善了全株玉米青贮的发酵品质，改变其养分组成，增加了DM 瘤胃降解率。LGG 组CP 降解率在0～8 h 低于CON 组，在8～72 h 高于对照组，且在16、24、36、72 h 差异显著。对于NDF 瘤胃降解率，在0～12 h 2 组处于相近水平，在12～72 h LGG 组高于CON 组，且在24、36、48、72 h 后差异显著。

图1 LGG 对全株玉米青贮DM、CP 和NDF 瘤胃降解率的影响

2.3.2 LGG 对全株玉米青贮瘤胃降解参数的影响如表5 所示，LGG 处理后全株玉米青贮DM 的c 值和ED 均显著高于CON 组。与CON 组相比，LGG 处理组显著提高了CP 的a 值、c 值和ED。而LGG 处理则主要提高了NDF 的b 值和ED（P＜0.05）。

表5 LGG 对全株玉米青贮瘤胃降解参数的影响

3 讨论

3.1 LGG 对全株玉米青贮常规营养成分影响营养价值是评价青贮饲料最为重要的指标之一。DM 含量直接反映了底物营养成分的浓度，以往研究发现在青贮玉米中添加乳酸菌可显著减少DM 损失[16-17]。本研究中LGG组的DM 含量在发酵48 d 后显著高于CON 组，其原因主要为全株玉米发酵底物充足，添加LGG 促进了青贮前期LA 发酵，加速了青贮内环境的酸化，进而抑制了有害微生物的活性，从而减少DM 损失[16-17]。本试验中，LGG 组的ADF 和NDF 含量均低于CON 组，在36 d 后差异显著。王海林等[18]研究发现，乳酸菌制剂处理显著降低了去穗玉米结青贮饲料中NDF 和ADF含量，这与本试验结果一致。纤维含量降低可能是由于青贮初期细胞呼吸和酶解过程所导致，也可能是由于添加LGG 增加了青贮中有效乳酸菌数量，大量乳酸菌发酵利用部分纤维而导致NDF 和ANF 含量较CON 组有所降低。有研究表明，乳酸菌的发酵活动是利用半纤维素进行生长繁殖[19]。Li 等[20]报道，在玉米秸秆中接种复合乳酸菌剂CP 含量显著升高。这与本研究的CP 变化一致，可能是由于LGG 通过降低全株玉米在储存过程中蛋白质的降解作用或抑制腐败微生物的分解作用，

从而降低了总氮中NH3-N 含量，间接提高了CP 含量。徐炜等[21]使用全株裹包青贮方式制作苜蓿青贮，添加乳酸菌提高了青贮饲料中EE 含量。本试验中2 组EE含量有略微提高，但差异不显著，原因可能是微生物对EE 不会产生作用，发酵造成DM 损失，进而使EE 含量增加，但DM 含量过高导致EE 含量变化较小。

3.2 LGG 对全株玉米青贮发酵品质的影响全株玉米是制作青贮的主要原料，只要形成良好的厌氧环境，青贮就容易成功。但其自身的乳酸菌数量往往较低，不能在较短时间内快速成为优势菌群，从而造成青贮原料营养的损失，且开窖后容易发生二次发酵，引起青贮饲料营养的进一步损失，甚至腐烂变质。在青贮过程中加入乳酸菌剂可以提高其青贮发酵品质[22]。刘玉婷等[6]研究发现，添加LGG 能显著降低青贮饲料的pH 并提高LA含量。本试验中，随着发酵天数增加，LGG 组与CON组的pH 均下降，且LGG 组CON 组差异显著，表明添加LGG 能更好地为发酵提供酸性环境，进而抑制有害菌生长，保证饲料品质。本试验结果表明，在青贮第36 天，LGG 组的LA 和AA 含量均高于CON 组，表明添加的LGG 能很好定植，并能在青贮发酵饲料中起到重要作用。BA 是由腐败菌和酪酸菌分别分解蛋白质、葡萄糖和乳酸而生成的产物，其含量的高低反映青贮饲料品质的优劣，BA 含量越多，青贮品质越差[23]。本试验在所有样品中均未检测到BA，表明青贮品质良好。

3.3 LGG 对全株玉米青贮瘤胃降解率的影响 DM 瘤胃降解率是影响反刍动物干物质采食量（DMI）的一个重要因素。伴随着植物成熟，植物的细胞内容物增加而可消化细胞壁含量降低，导致干物质降解率降低[24]，此外，营养组分的不同以及快速降解或慢速降解部分比例不同，也会导致DM 瘤胃降解率出现差异。本试验中，在全株玉米样品中接种LGG 菌株发酵48 d 后，其DM有效降解率显著增加，说明LGG 处理不仅提高了发酵品质，同时提高了全株玉米青贮的可降解组分。此外，LGG 处理同样显著增加了CP 和NDF 的ED。苗树君[25]研究指出，利用乳酸菌制剂处理去穗玉米秸青贮可提高其CP 和NDF 的瘤胃有效降解率。张佩华等[26]研究表明，经过微生物发酵处理能够提高玉米秸秆在瘤胃内各个时间点的NDF 降解率。上述研究结果均与本试验结果一致。NDF 的瘤胃降解率是表示粗饲料营养价值的一个重要指标，饲料NDF 组成会影响到NDF 瘤胃内的降解率。本研究结果表明，LGG 处理能够改善全株玉米青贮中NDF 组分，利于瘤胃降解。