从江香猪源干扰素γ 植物表达载体构建及在生菜中瞬时表达

田 浪，温贵兰*，张升波，杨佰启，李昌红，徐 丽，陈 广，张喜懿

（1.贵州大学动物科学学院预防兽医实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵州贵阳 550016）

从江香猪主产于贵州省从江县，属于中国稀有微型地方优良品种猪，从江香猪具有基因纯合、近交不退化、适应性强和抗病力强等优点，是猪相关疾病研究的理想动物模型，具有重要的研究价值[1-2]。近年来随着养猪业规模不断扩大，猪的各种病毒性疾病发生也不断增多，造成重大的经济损失，严重制约了养猪业的健康发展，研制高效、经济、安全广谱抗猪病毒性疾病的药物制剂显得尤为重要。

干扰素γ（Interferonγ，IFNγ）是由Dijkmans 等于1990 年发现的一种由NK 细胞和T 细胞产生的细胞因子，具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节作用[3-4]。猪IFNγ 在猪细胞免疫和体液免疫有着重要作用，特别在抗猪病毒性疾病方面发挥独特作用。有研究报道，猪IFNγ 对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、疱疹病毒、星状病毒等具有明显的抑制作用[5-7]，在抗猪病毒性疾病的药物制剂研究中具有广阔的开发利用前景[8]。传统的利用细菌、酵母、细胞表达生产动物药物蛋白活性低或者成本高昂，随着分子生物技术和遗传转化技术的快速发展，用植物生产动物药物蛋白已成为动物药物蛋白生产的一个新的研究领域。

本研究利用GenBank 登录的猪IFNγ 基因序列设计1 对特异性IFNγ 引物，采用RT-PCR 方法从贵州从江香猪源肝脏组织扩增IFNγ 基因序列，将其克隆至植物表达载体，转入根癌农杆菌并运用真空渗透法感染新鲜生菜叶片，检测IFNγ 基因在生菜中表达情况，以期为从江香

1.1 主要材料 贵州从江香猪源肝脏组织采自贵州省贵阳市乌当区绿生源畜牧科技公司香猪生态福利养殖场；新鲜意大利生菜（Lactuca sativa L.var.ramosa Hort.）购自贵州省花溪区某农贸市场；猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）GZBJ201712 株、Marc 145 细胞由本实验室保存。

1.2 主要试剂 根癌农杆菌LBA4404 感受态细胞购自上海维地生物技术有限公司；RNA 提取试剂盒、乙酰丁香酮、2-（N-吗啡啉）乙磺胺（MES）、2×Es Taq DNA 聚合酶、HiFiScript cDNA Synthesis Kit 试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；胶回收试剂盒、无内毒素质粒小提中量试剂盒、限制性内切酶Sam I、限制性内切酶Xba I、DL10000 DNA Marker、 DL2000 DNA Marker、GUS 染液试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；猪IFNγ 酶联免疫吸附测定试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；植物双元表达载体PBI121 购自上海继和生物科技有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

1.3 引物的设计与合成 参考GenBank 登录的猪IFNγ基因序列（登录号：GQ415073），利用DNA Star 软件设 计IFNγ 引物 序列：IFNγ-SmaI-F：5´-CCCCCGG GATGAGTTATACAACTTATTTC-3´，IFNγ-XbaI-R：5´-GCTCTAGATTATTTTGATGCTCTCTGGC-3´，预 扩增片段为501 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 总RNA 提取及cDNA 合成 取贵州从江香猪源肝脏组织于研钵进行研磨，12 000 r/min 离心10 min 取上清，根据RNA 提取试剂盒操作步骤提取总RNA，同时逆转录试剂盒操作步骤合成cDNA。cDNA 可直接用于PCR 反应或置于-20℃保存。

1.5 从江香猪源IFNγ PCR 扩增 以1.4 逆转录合成的cDNA为模板进行IFNγ PCR 扩增，PCR 反应体系20 μL：2×Es TaqDNA 聚 合 酶10 μL；IFNγ-SmaI-F 0.5 μL；IFNγ-XbaI-R 0.5 μL；cDNA 2 μL；ddH2O 7 μL。振荡混 匀 瞬时离心，PCR 扩增反应条件：94℃预变性2 min；94℃变性30 s；5℃退火30 s；72℃延伸1 min，共35 个循环；猪源IFNγ 药用植物蛋白的研究开发提供参考依据。

1 材料与方法

72℃再延伸10 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测鉴定。

1.6 从江香猪源IFNγ 植物表达载体的构建 通过生工胶回收试剂盒将1.5 扩增产物进行纯化回收，回收的PCR产物与植物表达载体 PBI121 分别用Sma I 和Xba I 进行双酶切，37℃水浴，酶切 4 h，酶切体系（40 μL）：10×Buffer 4 μL；0.1% BSA 2 μL；Sma I 2 μL；Xba I 2 μL；回收产物15 μL；ddH2O 15 μL。用胶回收试剂盒对酶切进行纯化回收，将回收产物与PBI121 16℃连接4 h，连接体系（10 μL）：回 收 产 物4.5 μL；PBI121 0.5 μL；Solution I 5.0 μL。将重组质粒命名为PBI121-IFN γ。

将连接产物（PBI121-IFN γ）和空载体（PBI121-Vec）转化根癌农杆菌LBA4404 中，将转化细菌接种到含卡那、利福平的LB 平板上，倒置平板于28℃培养过夜；PCR 筛选阳性克隆，将阳性克隆接种于含卡那、利福平的LB 液体培养基中，28℃振荡培养过夜；用无内毒素质粒小提中量试剂盒提取质粒DNA，PCR 与酶切鉴定，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

1.7 从江猪源IFNγ 在生菜中的表达与检测 新鲜生菜去除损伤叶片，用自来水漂洗2～3 次，再用无菌水漂洗2～3 次后超净工作台内风干，参照文献[9]对从江猪源IFNγ 在生菜中进行真空瞬时表达，在温度22℃、光照强度2 000 Lx 植物光照培养箱中光照培养2 d（每天光照16 h，黑暗8 h），收取生菜叶进行GUS 染色检测和ELISA 检测。GUS 染色检测参照GUS 染液试剂盒说明书进行。

取生菜叶加入植物蛋白提取缓冲液（NaCl 8.9 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g；ddH2O 定 容至1 000 mL，4℃保存），冰浴研磨，4℃，12 000 r/min离心10 min，上清液即为生菜蛋白液，ELISA 检测参照猪IFNγ 酶联免疫吸附测定试剂盒说明书进行。

1.8 从江猪源IFNγ 生菜中表达蛋白抗PRRSV 活性检测将1.7 提取的蛋白液按照BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书进行。将Marc145 细胞以每孔100 μL 细胞液分装入96 孔细胞培养板中，置37℃ 5% CO2培养24 h。96孔细胞培养板培养Marc145 细胞至单层后，分别加入100 μL 4 倍倍比稀释的从江猪源IFNγ（PBI121-IFN γ）和空载体（PBI121-Vec），每一稀释度设3 个重复，放入37℃ 5% CO2细胞培养箱24 h，弃掉蛋白液。

向接蛋白细胞孔加入100 TCID50 的PRRSV 病毒液，同时设置阳性对照组（加病毒不加干扰素）和阴性对照组（不加干扰素和病毒），继续培养72 h 并观察细胞病变效应（Cytopathic Effect，CPE）。

2 结果与分析

2.1 从江香猪源IFNγ PCR 扩增结果 采用IFN-γ 引物以1.4 合成的cDNA 为模板对IFNγ 基因片段进行PCR扩增，扩增结果显示，目的条带约为501 bp，与预期结果一致（图1）。

图1 IFNγ PCR 组织扩增凝胶成像电泳图

2.2 从江香猪源IFN γ 植物表达载体的构建 对从江猪源IFNγ 植物表达载体PBI121-IFNγ 进行PCR 与酶切鉴定，凝胶电泳检测（图2、3），测序获得基因序列与GenBank 公布的参考猪源IFNγ 基因序列进行相似性对比，发现同源性均达到99%。

2.3 从江猪源IFNγ 生菜中表达与检测结果 取含从江香猪IFNγ 质粒的根癌农杆菌感染的生菜叶片进行GUS染色，若生菜表达GUS，在适宜条件下，该酶可将X-Gluc水解生成蓝色产物，用肉眼或在显微镜下可观察到，对照组未见蓝色产物（图4），初步证明从江猪源IFNγ转入生菜中。取含PBI121-IFNγ 和PBI121-Vec 质粒生菜叶片提取生菜蛋白，由表1 可知，从江猪源IFNγ 在生菜中成功表达。

图2 PBI121-IFNγ 质粒PCR 扩增凝胶成像电泳图

图3 PBI121-IFNγ 双酶切鉴定结果

图4 PBI121-IFNγ 生菜中 GUS 染色显微效果（10×40）

表1 ELISA 检测生菜中瞬时表达的从江猪源IFNγ 蛋白

2.4 从江猪源IFNγ 生菜中表达蛋白抗PRRSV 活性检测结果 提取从江猪源IFN-γ 生菜中表达蛋白按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行测定，测得蛋白浓度为1.5 mg/mL。细胞病变抑制法分析表明，从江香猪源PBI121-IFNγ 生菜中表达蛋白表现出一定的抗病毒活性，IFN-γ 经4-6稀释仍能够有效抑制100TCID50 的PRRSV 对Marc145 细胞的致病作用（表2）。

3 讨 论

猪干扰素（Interferon，IFN）是机体受到病毒入侵刺激后由干扰素诱生剂诱导产生的一种最理想抗病毒药物蛋白[10]。猪IFN 分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，其中猪IFNγ 为Ⅱ型干扰素，主要通过诱导MHC Ⅰ、MHC Ⅱ类分子的表达提高抗原提呈能力、参与辅助性 T 细胞的调节、提高单核巨噬细胞的吞噬能力、提高嗜中性白细胞的吞噬能力来发挥抗病毒能力。猪IFNγ 在猪抗病毒感染的抵御过程中有着重要的作用[11]。本实验在植物表达载体的构建中，选择了植物表达载体常用载体PBI121，在扩增猪IFNγ 基因的特异性引物两端引入Sma I、Xba I 酶切位点，使得基因片段更易与植物表达载体PBI121 连接，成功从贵州从江香猪源肝脏组织扩增IFNγ 基因序列，其cDNA 序列长度为501 bp，这一结果与吴文学等[12]报道的结果一致；成功构建了从江香猪源IFNγ 植物表达载体。将构建好的江香猪源IFNγ植物表达载体利用根癌农杆菌LBA4404 真空渗透法感染生菜叶片虽获得了有免疫反应性的从江香猪源IFNγ植物蛋白，但从检测情况来看还是存在表达量低的问题，与罗雯等[13]通过生菜表达EV71 抗原存在同样的问题，分析原因可能受根癌农杆菌菌株、物种间基因表达系统存在差异、猪源IFNγ 在生菜中表达时间短以及表达猪源IFNγ 后样品检测时间等因素的影响。笔者实验室已准备开展利用不同的根癌农杆菌菌株来感染不同品种生菜，以期获得较高的表达量。

表2 从江猪源IFN-γ 抑制 PRRSV 致病变结果

猪IFNγ 在猪体内表达量低，因而提取、纯化天然的IFNγ 难度大、价格昂贵。利用转基因技术体外表达猪IFNγ 的研究已有报道，可以使猪IFNγ 在体外的表达且具有抗病毒活性。本实验采用细胞病变抑制实验检测从江香猪源IFNγ 生菜中表达蛋白抗病毒活性，IFN-γ经4-6稀释仍能够有效抑制100TCID50 的PRRSV 对Marc145 细胞的致病作用，表明对PRRSV 增殖具有较强抑制作用，与梁望旺等[11]利用大肠杆菌表达系统表达猪IFNγ、张瑞华等[14]利用毕赤酵母表达系统表达猪IFNγ、钟鲁龙[15]利用家蚕幼虫体内表达猪IFNγ 的抗病毒活性研究结果一致，为从江香猪源IFNγ 药用植物蛋白的研究开发提供参考依据。