调控民猪ZBED6 基因转录元件的筛选与分析

2019-07-17张冬杰李忠秋

中国畜牧杂志 2019年7期

张冬杰，刘洋，汪亮，李忠秋，刘娣,*

（1.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，黑龙江哈尔滨 150086；2.农业农村部种养结合重点实验室，黑龙江哈尔滨 150086；3.东北农业大学动物科技学院，黑龙江哈尔滨 150030）

胰岛素样生长因子2（Insulin-like Growth Factor-2，IGF2）是20 世纪70 年代发现的一种促生长因子，在胎儿生长发育、肌肉生长以及基因印迹等方面具有重要的调控作用[1]。2003 年，van Laere 等[2]研究发现，猪IGF2 基因内含子3 中的单碱基突变（G3072A）会导致骨骼肌中IGF2 表达量上调3 倍、瘦肉率升高、皮下脂肪减少。究其原因是单碱基突变（G3072A）破坏了转录调控因子锌指蛋白ZBED6（Zinc Finger BED-Type Containing 6，ZBED6）的结合位点，使其无法正常结合到IGF2 基因上，至此，ZBED6 基因作为IGF2 的转录抑制因子进入人们的视线。

ZBED6 是锌指蛋白家族的一员，在胎盘哺乳动物中极其保守。ZBED6 基因无内含子，是从一个驯化的DNA 转座子进化而来，位于ZC3H11A（Zinc Finger CCCH-Type Containing 11A）基因的第1 个内含子中，其编码蛋白包含2 个BED 结构域和1 个hATC 二聚体功能域。如果在小鼠的C2C12 成肌细胞中沉默ZBED6，IGF2 的表达水平会显著上升、细胞增殖能力增强、伤口愈合进程加快。同时发现，ZBED6 在C2C12 细胞基因组上的结合位点超过2 000 个，其中包括很多与发育和转录调控相关的基因[3]。ZBED6 除了通过IGF2 参与调控骨骼肌生长外[4]，还会抑制胰岛素的产生、细胞聚合以及神经元的分化[5]；在同一物种内的表达也具有明显的时空特异性[6]。由此可知，ZBED6基因的生物学功能非常复杂，需要不断探索。

为了深入研究猪ZBED6 基因的生物学功能，本研究通过构建系列缺失载体、利用重叠PCR 以及双荧光素酶检测技术开展了民猪ZBED6 基因自身转录调控的研究，以期获得调控ZBED6 转录的分子元件，为后续该基因的生物学功能研究以及基因编辑等提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料民猪基因组DNA，为本实验室保存。

1.2 民猪ZBED6 基因启动子区的克隆在NCBI 中检索猪的ZBED6 基因（GenBank：XR_001304140.2）的5'侧翼序列信息。利用Primer5.0 软件分别设计上、下游引物A 和R1，预期扩增长度为2 032 bp，位置为-2 053～-21 bp（以翻译起始密码子“A”为+1），两端分别引入酶切位点Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ。引物序列（下划线为内切酶识别序列）：A：5´-GGTACCGCATTCCTTGGAA AGGCAGGG-3´，R1：5´-AAGCTTTCGTAGCAGAAT CTGTTAGTGGGTT-3´。

以民猪基因组DNA 为模板扩增ZBED6 基因启动子区域。PCR 反应体系20 µL：DNA 1 µL，2×Taq Master Mix 10 µL，上、下游引物（10 µmol/L）各0.5 µL，ddH2O 补齐；PCR 反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58.3℃退火30 s，72℃延伸120 s，共计30 个循环；最后72℃延伸10 min。扩增结束后，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，观测到目的条带后，使用胶回收试剂盒回收目的条带。将回收后的目的片段连入pMD18-T 载体构建克隆质粒pMD18-ZBED6，反应体系10 µL：Solution Ⅰ5 µL，pMD18-T 0.5 µL，胶回收产物4.5 µL；反应条件：16℃过夜连接。连接结束后将连接产物转入大肠杆菌DH5α 感受态细胞，转化产物涂于LB 固体培养基，37℃倒置过夜培养，培养结束后挑取阳性克隆菌落，PCR 鉴定，将阳性克隆送交吉林省库美生物科技有限公司测序。将序列正确的克隆菌株加入LB 液体培养基内，重新摇菌扩繁后，小规模提取质粒，用于后续载体的构建。

1.3 报告基因质粒pGL3-Basic-ZBED6 的构建将pGL3-Basic 空载体和pMD18-ZBED6 质粒分别经Kpn I 和HindⅢ双酶切后，使用T4 连接酶过夜连接，酶切体系10 μL：Hind Ⅲ 0.5 μL；Kpn I 0.5 μL；10×M Buffer 1.0 μL；质粒1.0 μL；ddH2O 7.0 μL。反应条件：37℃水浴10 min。连接体系25 μL：10×T4 DNA 连接Buffer 2.5 μL，DNA片段5 μL，载体1 μL，T4 DNA 连接酶1 μL，ddH2O 15.5 μL，反应条件：14℃过夜连接。连接结束后将连接产物转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞中，筛选阳性重组质粒，经菌液PCR 验证后，严格按照无内毒素质粒提取试剂盒说明书操作，提取无内毒素质粒，使用紫外分光光度计进行纯度的检测，检测合格后，置于-20℃保存备用。

1.4 民猪ZBED6 基因启动子区系列缺失载体的构建以引物A 和R1 所扩增的片段为基础，设计7 对系列缺失引物，引物信息见表1，其中R1 为通用下游引物，以重组质粒pMD18-ZBED6 为模板扩增系列截短型片段，反应体系及反应条件同上，退火温度均为55℃。反应结束后各系列片段按照1.2.2 方法分别连入pGL3-Basic 载体内。第1 轮构建了5 个截短型质粒，分别命名为pB（-1897/-21）-ZBED6、pC（-1863/-21）-ZBED6、pD（-1808/-21）-ZBED6、pG（-1777/-21）-ZBED6 和pH（-1462/-21）-ZBED6。第2 轮构建了2 个截短型质粒，分别命名为pE（-1800/-21）-ZBED6 和pF（-1787/-21）-ZBED6。

表1 扩增ZBED6 基因截短型启动子所用引物

1.5 猪肾源PK15 细胞的体外培养按照Lipofectamine ™ 2000 Transfection Reagent 严格进行转染，转染前1 d 将细胞以4×105～8×105个细胞/孔的密度接种于DMEM 培养基中（24 孔板），第2 天转染时的细胞要达到80%～90%汇合，按照脂质体∶报告基因质粒∶pRLTK 为2 μL∶0.5 μg∶0.00125 μg 的比例共转染于猪PK15细胞中，转染4～6 h 后换成含有血清的培养基继续培养，24 h 后收集细胞，进行荧光素酶活性检测。以上实验独立重复3 次。

1.6 荧光素酶活性检测严格按照普洛麦格公司生产的双荧光素酶报告基因检测系统（Dual-Luciferase Reporter Assay）产品说明书操作：取出24 孔板，弃掉原有细胞培养液，PBS 洗涤细胞1 次，每孔加入100 μL 细胞裂解液，37℃烘箱中放置15 min 后，收集细胞裂解液，离心5 min，取50 μL 上层细胞裂解液加入荧光测定管中，加入30 μL 检测试剂（Firefly Luciferase，LAR Ⅱ），轻轻混匀后测定发光值，再加入30 μL Stop&GLo，测定Renila 荧光素酶发光值，二者的比值即为荧光素酶相对活性（RLA），RLA 的数值为3 次重复实验结果的平均值±标准差。

1.7 民猪ZBED6 基因启动子区调控元件的预测根据3 个转录因子预测网站（http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html、http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3、http://jaspar.genereg.net）对ZBED6 基因的启动子区进行预测分析。根据预测结果，探讨该基因启动子区可能存在的调控元件。

1.8 民猪ZBED6 基因启动子区调控元件的筛选与验证根据在线软件的预测结果，设计并合成用于ZBED6 基因启动子区各转录因子结合位点缺失的引物，引物序列见表2。利用重叠延伸PCR 法获得定点突变片段，重叠延伸PCR 主要通过3 个PCR 反应完成：①以Adf-1调控元件的突变为例，首先以pMD18-ZBED6 质粒为模板，用正向侧引物A 和突变引物Del- Adf-1-R 进行PCR1 扩增，扩增产物含有突变位点及其上游片段；②以pMD18-ZBED6 质粒为模板，用反向侧引物RS 和突变引物Del-Adf-1-F 进行PCR2 扩增，扩增产物含有突变位点及其下游片段；③分别胶回收PCR1 和PCR2 扩增产物，等比例混合后，以此为模板，使用正反向引物A 和RS 进行PCR3 扩增，扩增产物即为引入目的突变的靶序列，然后按照上述方法连入pGL3-basic 载体。其他调控元件缺失载体的构建均按照此方法进行。

2 结果

2.1 民猪ZBED6 基因启动子区的克隆测序以猪耳组织样DNA 为模板，以特异性引物A 和R1 进行ZBED6基因5′侧翼区扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测后在2 000 bp 左右发现单一、明亮的条带，与预期的2 032 bp相符。将目的片段纯化、克隆测序后与NCBI 数据库中猪的ZBED6 基因（登录号为XR_001304140.2）序列相比，相似度为99.26%，说明序列扩增正确。

2.2 报告基因质粒pGL3-Basic-ZBED6 的构建从图1可见，双酶切后，有一条长约2 000 bp 的片段从质粒中成功切下，与连入的ZBED6 基因片段大小相符，说明目的片段已成功连入pGL3-Basic 载体。

图1 pA（-2053/-21）-ZBED6 质粒酶切鉴定图谱

图2 pA（-2053/-21）-ZBED6 双荧光素酶活性分析

表2 ZBED6 基因启动子区调控元件缺失突变所用引物

2.3 荧光素酶活性检测如图2 所示，与空白对照相比，pA（-2053/-21）-ZBED6 具有明显的启动子活性，表明-2 053～-21 bp 片段内含有调控民猪ZBED6 基因转录的调控元件。2.4 第1 轮系列长度缺失载体的构建如图3 所示，第6 泳道是最长的原始片段pA（-2053/-21），长度为2 032 bp，从右至左，依次截短，至第1 泳道为最短的pH 片段，长度为1 441 bp。

图3 民猪ZBED6 基因启动子截短型报告基因质粒酶切鉴定图谱

2.5 第1 轮系列载体的双荧光素酶活性分析如图4 所示，重组质粒pB（-1897/-21）-ZBED6 和pC（-1863/-21）-ZBED6（P＜0.05）、pC（-1863/-21）-ZBED6（P＜0.05）和pD（-1808/-21）-ZBED6（P＜0.05）、pD（-1777/-21）-ZBED6 和pG（-1808/-21）-ZBED6（P＜0.01）之间的双荧光素酶活性存在显著差异，预测-1 897～-1 863 bp、-1 863～-1 808 bp 以及-1 808～-1 777 bp 存在调控ZBED6 基因转录的增强子，其中-1 808～-1 777 bp 片段距离“ATG”起始密码子最近，而且该片段的缺失造成了启动子活性的极显著降低，因此后续研究主要以该片段为主。

图4 截短型启动子荧光素酶活性分析

2.6 第2 轮系列长度缺失载体的构建及双荧光素酶活性的测定根据第1 轮重组质粒的双荧光素酶活性测定结果，推测在-1 808～-1 777 bp 存在1 个正调控元件，据此构建第2 轮系列长度缺失载体。如图5 所示，pD 截短至pE 后启动子活性降低（P＜0.01）；pE 截短至pF后启子活性降低（P＜0.05）；pF 截短至pG 后启动子活性降低（P＜0.05）。根据荧光信号的强弱，推测pD 和pG 之间即-1 808～-1 777 bp 存在重要的转录增强子，尤其是-1 808～-1 800 bp。

图5 截短型启动子荧光素酶活性分析

2.7 核心区域的调控元件预测根据上述检测结果，利用在线生物学软件对-1 808～-1 777 bp 区间潜在的转录因子结合位点进行了预测。综合3 个网站的预测结果，初步选定结合位点为-1 805～-1 798 bp 的Adf-1、-1 814～-1 803 bp 的HINFP 和-1 787～-1 774 bp 的CREB3 作为潜在的转录调控元件开展下一步研究。

2.8 潜在的转录元件缺失突变分析以pA（-2053/-21）-ZBED6 质粒为模板，以重叠延伸PCR 中第3 轮扩增用的A 和RS 为引物，扩增片段，连入pGL3-Basic 载体，构建阳性对照重组质粒（-2053/-1565）-pGL3，以pGL3-Basic 空载体为阴性对照，同时检测阳性对照、阴性对照和各转录元件缺失报告基因载体的双荧光素酶活性。如图6 所示，缺失CREB3、Adf-1 和HINFP 转录元件后，双荧光素酶活性均显著降低（P＜0.05）。

图6 不同元件缺失对ZBED6 基因启动子活性的影响

3 讨论

真核生物的启动子包括核心启动子区和上游序列区，核心启动子区位于结构基因的5'端上游，能活化RNA 聚合酶，使之与模板DNA 准确地结合并具有转录起始的特异性，在该区内还存在许多短的核苷酸序列，为转录因子结合位点[7]。转录因子是基因表达调控过程中的重要调节因子，它与RNA 聚合酶Ⅱ形成转录起始复合体，共同参与转录起始过程。转录因子主要分为2种，一种是非特异性转录因子，非选择性的调控基因转录；另一种是特性转录因子，它们能够选择性地调控某种或某些基因的转录。同时，不同的转录因子之间还可以通过多种方式相互结合，为这一调控过程提供了更多的可能[8]。

大约在2 亿年前，一个DNA 转座子整合到一种原始哺乳动物的基因组中，数百万年后，它在所有胎盘哺乳动物的共同祖先中进化出一种基本的功能[9]，这个转座子现被命名为ZBED6，在多个组织内广泛表达，是非特异性转录因子。Huang 等[10]发现，黄牛的ZBED6基因的启动子核心区位于-866 bp～-556 bp，其-826G＞A的突变会造成转录因子PLZF 结合位点的改变，野生型M-826G-pGL3 的启动子活性显著高于突变型。ZBED6最早是在猪的肌肉组织中发现的，为了全面深入了解该转录因子的遗传学特性，本研究采用系列截短的方式，筛选民猪ZBED6 基因的核心启动子区。

最初，根据传统经验构建了一段长约1 000 bp 的ZBED6 基因5'端上游序列的报告载体，但经双荧光素酶检测后发现，此片段无启动子活性。随后，将片段延伸至上游2 000 bp，再次检测发现此片段具有明显的启动子活性，说明转录因子在ZBED6 启动子区上的识别位点距离编码区较远。通过构建一系列缺失片段的报告载体，最终发现该基因上游启动子区从-1 808 bp 至-1 777 bp 的片段具有明显的启动子活性，推测调控ZBED6基因转录的反式作用因子位于-1 808～-1 777 bp。利用在线软件预测及双荧光素酶实验验证发现，定点缺失掉Adf-1、HINFP 和CREB3 转录因子的结合位点后，ZBED6 基因的启动子活性均发生显著降低，尤其是Adf-1 转录因子结合位点的缺失，启动子活性下降最为显著，预测结果与验证结果基本一致。

转录因子HINFP 是一个具有2 种不同功能的转录因子，根据细胞环境不同，可以激活或抑制靶基因的转录，但其通常需与其他物质形成复合体后才能发挥作用。如在细胞周期由G1 期向S 期转变的过程中，HINFP 需与NPAT（Nuclear Protein Ataxia-Telangiectasia）蛋白形成转录复合体后才会作用于组蛋白H4 的启动子[11]。转录因子Adf-1 是Myb 基因家族的一员，Myb 基因家族是一类重要的转录因子家族，广泛分布在动物、植物、真菌和原生生物中，是植物中最大的一类转录因子，参与植物发育和代谢的网络调节等生命过程。Adf-1 可通过调节细胞粘附和mRNA 转运2 个关键过程控制果蝇大脑内树突的发育[12]。转录因子CREB3 是ATF（激活转录因子）/CREB（cAMP 反应元件结合蛋白）家族中重要的一员，是真核生物中广泛存在的一类基础转录因子，该家族共同的结构特征是碱性亮氨酸拉链（bZIP）模体。该家族蛋白涉及到细胞的增殖、分化、凋亡、胞外刺激和应激反应等细胞生命过程[13]。