高效液相色谱法同时测定咽炎合剂中绿原酸、葫芦素B、哈巴俄苷及重楼皂苷含量

沈红祥，徐加兵

（1.江苏省扬州市中医院，江苏 扬州 225002； 2.江苏省泰州市药品检验所，江苏 泰州 225300）

咽炎合剂为扬州市中医院常用中药制剂（批准文号为苏药制字Z04001168），由金银花、桔梗、重楼、天花粉、玄参、乌梅、生甘草7味中药组方，具有清热解毒、化痰利咽功效，用于治疗急慢性咽喉炎。本研究中参考文献[1-6]，采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定咽炎合剂中绿原酸、葫芦素B、哈巴俄苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅱ及重楼皂苷Ⅰ的含量，为全面评价和控制咽炎合剂的质量提供试验依据。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Xplorer型微量移液器（德国艾本德公司）；GTS型智能超声清洗机（广东固特超声股份有限公司）；XSE型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

试药：绿原酸对照品（批号为111871-201706，含量为 96.8%），葫芦素 B对照品（批号为 111945-201301，含量为 96.8%），哈巴俄苷对照品（批号为111730-201709，含量为95.9%），重楼皂苷Ⅶ（批号为111593-201604，含量为94.0%），重楼皂苷Ⅱ（批号为111591-201604，含量为91.4%），重楼皂苷Ⅰ（批号为111590-201604，含量为93.6%），均购自中国食品药品检定研究院；咽炎合剂（扬州市中医院自制，批号分别为 20171006，20171015，20171028，规格为每瓶 250 mL）；乙腈、冰醋酸为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：PhenomenexC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.05% 醋酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min时 15%B→30%B，10～20 min时 30%B→42%B，20～34 min时 42%B→51%B，34～46 min时51%B→60%B，46～60min时60%B→80%B）；检测波长：330 nm（0～10 min），之后为 210 nm；流速：1 mL／min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

称取绿原酸、葫芦素B、哈巴俄苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅱ及重楼皂苷Ⅰ对照品各适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成各成分质量浓度分别为 258.5，69.8，100.6，127.2，105.4，109.1 mg／L 的混合对照品溶液。精密量取供试品5 mL，水浴蒸干，加甲醇溶解并定容至100 mL，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方比例和样品制备工艺制成不含金银花、天花粉、玄参及重楼4味药材的阴性对照品，按供试品溶液配制方法制得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下3种溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，得色谱图（见图 1）。可见，阴性对照品溶液色谱在绿原酸、葫芦素B、哈巴俄苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅱ及重楼皂苷Ⅰ出峰处无干扰，表明专属性较好。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液 0.25，0.50，1.00，2.50，5.00，10.00 mL，置 10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，摇匀。配制成分别含绿原酸 6.462 5，12.925 0，25.850 0，64.625 0，129.250 0，258.500 0 mg／L，葫 芦 素 B 1.745，3.490，6.980，17.450，34.900，69.800 mg／L，哈巴俄苷 2.515，5.030，10.060，25.150，50.300，100.600 mg／L，重楼皂苷Ⅶ3.18，6.36，12.72，31.8，63.6，127.2 mg／L，重楼皂苷Ⅱ2.635，5.270，10.540，26.350，52.700，105.400 mg／L和重楼皂苷Ⅰ2.727 5，5.455 0，10.910 0，27.275 0，54.550 0，109.100 0 mg／L的系列混合对照品溶液。按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以峰面积（A）为纵坐标、对照品溶液质量浓度（C）为横坐标进行线性回归。回归方程及线性范围见表 1。

表1 回归方程及线性范围（n=6）

精密度试验：精密吸取含绿原酸25.85 mg／L、葫芦素 B 6.98 mg／L、哈巴俄苷 10.06 mg／L、重楼皂苷Ⅶ12.72 mg／L、重楼皂苷Ⅱ10.54 mg／L、重楼皂苷Ⅰ10.91 mg／L的混合对照品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件重复进样6次，测定峰面积，结果的RSD分别为1.24%，0.96%，1.08%，0.90%，1.23%，0.89%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：精密量取样品（批号为20171028）6份，每份5 mL，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算样品含量。结果绿原酸、葫芦素B、哈巴俄苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅰ含量分别为 2.101，0.316，0.415，1.359，0.819，1.856 g／L，RSD分 别 为 1.28% ，1.17% ，1.32% ，1.05%，1.43%，1.26%（n=6），表明方法重复性好。

稳定性试验：精密吸取同一样品（批号为20171028）供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，室温下分别于 0，2，4，8，15，24 h 时进样，记录峰面积，结果绿原酸、葫芦素B、哈巴俄苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅰ峰面积的RSD分别为1.38%，1.17% ，1.42% ，1.36% ，0.68% ，1.33% （n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。

加样回收试验：精密量取已知含量的样品（批号为20171028）1 mL，共 6份，水浴蒸干，加甲醇溶解，置100 mL容量瓶中，加入2.2项下混合对照品溶液5 mL，加甲醇定容。经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液10 μL进样测定，记录峰面积，计算回收率。结果见表 2。

表2 加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

分别精密量取3批样品各5 mL，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算样品含量。结果绿原酸、葫芦素B、哈巴俄苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅰ平均含量分别为2.108，0.319，0.418，1.355，0.826，1.854 mg／g，RSD分别为0.74，0.63，0.72，0.54，1.19，0.60。

3 讨论

咽炎合剂组方中，金银花主要含有绿原酸等有机酸类，有清热解毒、疏散风热、凉血止痢、降血降火、消咽利膈之功效[7][8]221；天花粉主要含有葫芦素B，功效为清热泻火、生津止渴、排脓消肿[9]；玄参有清热凉血、滋阴降火、解毒散结功效，哈巴俄苷为玄参及其制剂质量控制的指标性成分[8]117；重楼可清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，常用于疔疮痈肿、咽喉肿痛、蛇虫咬伤、跌扑伤痛、惊风抽搐，有效成分主要为皂苷类，常以重楼皂苷作为重楼及其制剂的指标类成分[8]260。故本试验中选绿原酸、葫芦素B、哈巴俄苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅰ为指标进行含量测定。

预试验中，对各待测成分进行了全波长扫描，根据所得光谱，综合各成分的最大吸收波长，确定绿原酸检测波长为330 nm，葫芦素B、哈巴俄苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅰ的检测波长为210 nm，并经试验证明基线对各峰无干扰、分离效果良好，特异性强。采用色谱工作站的定时波长功能改变检测波长，提高了检测的灵敏度和准确性，具有灵敏准确、方便快速的特点。

选择流动相组成及比例时，分别对甲醇-水体系及乙腈-水体系下的色谱系统性能进行了考察。结果发现，乙腈-水体系梯度洗脱时的基线平稳性、峰形及分离度均显著优于甲醇-水体系，且可较好地分离6种成分，同时加入0.05%醋酸溶液使得峰形更优。

综上所述，本研究中建立的HPLC法可同时测定咽炎合剂中绿原酸、葫芦素B、哈巴俄苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅰ的含量，且该方法快速、准确、重复性高，可用于咽炎合剂的质量控制。