蕨麻多酚对血管内皮细胞糖氧剥夺损伤的改善作用研究*

陈 晔 ，刘 丹 ，李灵芝 ，3△，张永亮 ，李建宇 ，金 鑫

（1.武警后勤学院军事药学教研室，天津 300309； 2.武警北京总队医院药剂科，北京 100000；3.天津市职业与环境危害防制重点实验室，天津 300309； 4.武警后勤学院职业教育中心，天津 300309）

高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生、发展与慢性氧化应激的增加密切相关[1]。内皮细胞为接触血液的第一层细胞，需应对各种病理和生理挑战，如氧张力不足等[2]。缺氧会引起细胞内活性氧富集，自由基代谢紊乱，使细胞内氧化还原反应失衡，最终导致细胞凋亡。因此，对抗低氧诱导的血管内皮细胞损伤对于心血管疾病的治疗具有重要意义。蕨麻是蔷薇科委陵菜属植物鹅绒委陵菜的干燥膨大块根，具有耐缺氧、抗应激、抗氧化、补血和保护心肌细胞等活性[3]。其主要含有黄酮类、萜类、多酚类化合物[4]，其中咖啡酸、丁香酸、短叶苏木酚等多酚化合物具有抗氧化、抗内毒素及保肝等药理作用[5-8]。本研究中通过建立EA.hy926内皮细胞糖氧剥夺模型，探讨蕨麻多酚的抗缺氧损伤作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株、仪器与试药

细胞株：人脐静脉血管内皮细胞（EA.hy926，北京医科大学肿瘤研究所）。

仪器：371型CO2培养箱、3111型混合气体培养箱（美国Thermo Fisher公司）；Cytation 5型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；UV-1800型紫外分光光度仪（日本Shimadzu公司）；MJ Research PTC-200型聚合酶链反应仪（美国MJ Research公司）；Eppendorf 22331型核酸定量仪（德国Eppendorf公司）；成像分析系统（Gel Pro 4.5工作站）；IX71型光学显微镜（日本Olympus公司）。

试药：蕨麻多酚由天津武警后勤学院军事药学教研室高原医学实验室自制；复方丹参滴丸（天津天士力制药有限公司，批号为20151202，规格为每丸27mg）；乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮（NO）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批 号分别为 20140320，20140521，20140602，20161204）；内皮素 -1（ET-1）试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；Trizol Reagen（美国Invitrogen公司）；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（美国 Promega公司）；四氮唑盐（MTT，美国 Sigma公司）；胎牛血清（美国MRC公司）；DMEM培养液（北京索莱宝科技有限公司）；D-Hank′s溶液（天津武警后勤学院军事药学教研室高原医学实验室配制）。

1.2 方法

内皮细胞培养：将EA.hy926内皮细胞接种于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，于37℃及5%CO2条件下培养，待细胞生长密度达80% ～90%时，消化传代备用。

分组、给药及模型建立：取对数生长期细胞，用无血清的DMEM培养液培养24 h后分组，试验分为正常对照组（A组，DMEM培养液），模型组（B组，缺氧的DHank′s溶液），复方丹参滴丸组（C 组，2.4 g／L+ 缺氧的D-Hank′s溶液），蕨麻多酚高、中、低质量浓度组（D1组，2.4 g／L；D2组，1.2 g／L；D3组，0.6 g／L；分别加缺氧的D-Hank′s溶液）。A组细胞置5%CO2培养箱中培养，其余组细胞置5%CO2-95%N2的三气培养箱中缺氧培养2 h。

HE染色：取出单层细胞爬片的盖玻片，行HE染色，用中性树胶封片，于200倍显微镜下观察拍照。

1.3 观察指标

细胞活力：采用MTT试验将细胞消化计数，以5×103个／孔的密度接种于细胞培养板。按1.2项下方法操作，避光加20 μL MTT，置5%CO2培养箱中孵育4 h。弃上清，每孔加150μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，使蓝紫色结晶充分溶解，采用紫外分光光度仪测定吸光度（OD）值并计算细胞活力。细胞活力=（OD用药组-ODA组）／（ODB组-ODA组）。

LDH、NO及ET-1水平：将细胞消化计数，以8×103个／孔的密度接种于细胞培养板。按1.2项下方法操作，取上清液，1 000 r／min离心5 min，收集上清液，采用分光光度法测定LDH和NO水平，采用放射免疫法测定ET-1水平。

SOD及 MDA水平：将细胞消化计数，以 8×103个／孔的密度接种于细胞培养板。按1.2项下方法操作，用胰蛋白酶消化、离心、收集细胞。加1mL磷酸盐缓冲液（PBS），超声破碎细胞。采用BCA法测定蛋白浓度，采用分光光度法测定SOD和MDA水平，并计算SOD／MDA。

内皮型一氧化氮合酶（eNOS）及ET-1 mRNA表达水平：将内皮细胞接种于6孔板，待细胞长满后，按1.2项下方法操作，以D-Hank′s溶液洗涤细胞，Trizol法提取RNA，鉴定RNA纯度和完整性后，反转录制备cDNA，以 β-actin引物为内参。eNOS上游为5′-GCACA GGAAATGTTCACCTAC-3′，下游为 5′-GTATCCAGGT CCATGCAGAC-3′，扩增长度为 551 bP；ET-1 上游为5′-TTCTCTCTGCTGTTTGTGG-3′，下游为 5′-CAATGTGCTCGGTT GTG-3′，扩增长度为 614 bP；β-actin 上游为 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游为 5′-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，扩 增长度为547 bP。PCR 扩增反应条件为 94℃ 45 s，62℃ 45 s，72℃30 s，循环28次。扩增反应完成后，以1.5%琼脂糖凝胶、PCR 产物 5 μL，加 6×loading buffer 2 μL 混合上样，50 V电泳60 min。利用图像分析系统分析各条带光密度值，以 β-actin表达量为对照，计算各基因的相对表达量。

1.4 统计学处理

采用SPSS22.0统计学软件分析。计量资料以表示，行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色

A组细胞间联接密切，细胞间隙较小，胞浆饱满，呈红染，细胞核大，呈蓝染。B组细胞间隙略增大，胞浆红染变浅，细胞核固缩，呈深蓝染。与B组比较，C组及D1组细胞形态接近正常细胞形态。详见图 1。

图1 内皮细胞形态学（HE，×200）

2.2 细胞活力、LDH、NO和ET-1水平

与A组比较，B组细胞活力显著减弱，LDH活性显著增强，NO含量显著减少，ET-1显著增加（P＜0.01）。与B组比较，C组、D1组、D2组细胞活力均显著增强（P＜0.01），C组、D1组、D2组、D3组LDH活性均显著减弱，NO含量显著增加，ET-1含量显著减少（P＜0.01或P＜0.05），且LDH和NO变化呈量效依赖关系。详见表 1。

表1 6组内皮细胞活力与LDH、NO、ET-1水平比较（± s，n=6）

表1 6组内皮细胞活力与LDH、NO、ET-1水平比较（± s，n=6）

注：与A组比较，##P＜0.01；与 B组比较，**P＜0.01，*P＜0.05。表2和图2同。

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2.3 SOD和MDA水平

与A组比较，B组SOD活性显著减弱，MDA含量显著增加，SOD／MDA显著下降（P＜0.01）；与B组比较，D1组、D2组、D3组SOD活性显著增强（P＜0.01或P＜0.05），C 组、D1组、D2组、D3组 MDA 含量显著减少，SOD／MDA显著升高（P＜0.01）。详见表 2。

表2 6组内皮细胞SOD及MDA水平比较（± s，n=6）

表2 6组内皮细胞SOD及MDA水平比较（± s，n=6）

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2.4 eNOS mRNA和ET-1 mRNA表达水平

与A组比较，B组eNOS mRNA表达水平显著降低，ET-1 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；与B组比较，D1组和D2组eNOS mRNA表达水平均显著升高，C组、D1组、D2组ET-1 mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01）。详见图 2。

图2 6组内皮细胞中eNOSmRNA和ET-1mRNA表达水平比较

3 讨论

本课题组前期已建立起人脐静脉血管内皮细胞（EA.hy926）糖氧剥夺模型，在缺氧2 h后细胞活力显著降低，LDH漏出量显著增加，细胞存活率降至28%[9]，说明糖氧剥夺2 h已对内皮细胞造成严重损伤，因此本研究中选定内皮细胞缺氧时间为2 h。复方丹参滴丸是广泛应用于治疗心脑血管疾病的中成药，通过减少过氧化物生成、增加NO合成、减少ET-1合成来发挥保护内皮细胞的作用[10-11]，故本研究中选用其为阳性对照药物。试验结果显示，加入复方丹参滴丸有效成分后，与B组比较，细胞活力显著增强，NO合成显著增加，ET-1 mRNA表达水平及释放量均显著降低，与许晶兰等[11]的研究结果一致。

正常生理条件下机体内自由基的产生和抗氧化酶对自由基的清除处于动态平衡状态。SOD是机体产生的抗氧化酶之一，能清除机体在正常生理状态下产生的氧自由基。SOD活性与反映机体的自由基清除能力呈正相关[12]。临床还将MDA视为与SOD相互匹配的指标。作为脂质过氧化的产物，MDA可引起细胞肿胀，最终导致细胞膜破裂[13]。因此，MDA含量不仅反映自由基引起细胞受损的程度，同时也反映细胞脂质过氧化的严重程度。SOD／MDA能较客观地反映机体清除自由基的速率和自由基引起脂质过氧化水平[14]。LDH是一种糖酵解酶，是反映细胞膜完整性的敏感指标。本试验中，内皮细胞糖氧剥夺2 h后，B组细胞内SOD活性显著减弱，MDA含量显著增加，SOD／MDA显著降低，而LDH释放量显著增加，表明缺氧2 h已引起内皮细胞内氧化还原反应失衡，自由基堆积导致的细胞膜脂质过氧化损伤已引起细胞损伤；加入蕨麻多酚后细胞内SOD活性显著增强，MDA含量显著减少，SOD／MDA显著升高，同时LDH释放量显著减少，表明蕨麻多酚能对抗缺氧缺糖引起的内皮细胞氧化还原失衡，减轻自由基堆积诱导的内皮细胞过氧化损伤。

作为内源性舒张血管的活性物质，NO水平改变可导致动脉粥样硬化和心血管疾病。eNOS在正常内皮细胞中，eNOS能催化氧化L-精氨酸产生NO，以维持正常的心血管收缩功能，eNOS适当表达可维持血管壁功能，它反映了向周围组织器官供血的敏感程度和有效程度。缺氧下调了eNOS mRNA的表达，减少内皮细胞中NO生成，导致血管收缩和血栓形成[15]。本研究中，B组细胞中eNOS mRNA表达水平显著降低，NO含量显著减少；蕨麻多酚干预后，模型细胞eNOS mRNA表达水平显著升高，NO含量显著增加，表明蕨麻多酚能上调缺氧状态下eNOS mRNA的表达水平，促进NO的合成与释放，从而发挥保护内皮细胞的作用。ET-1是长效强血管收缩物质，能调节血管收缩和血压，参与高血压和其他多种心血管疾病的发生。缺氧／缺血能激活低氧诱导因子HIF-1α，进而上调ET-1的表达，最终导致血管收缩，血液流速降低[16]。本研究中，糖氧剥夺导致内皮细胞ET-1 mRNA表达水平显著升高，蕨麻多酚干预后细胞内ET-1 mRNA表达显著降低，表明蕨麻多酚能抑制糖氧剥夺引起的ET-1升高。

综上所述，蕨麻多酚对内皮细胞糖氧剥夺损伤具有明显的保护作用，其机制可能与对抗细胞内氧化应激失衡和维持NO与ET-1间的动态平衡有关。