川芎嗪联合CIK细胞对裸鼠肝癌HepG2细胞的影响*

黄 芬，王 波，卢彦达，曾江正，桑圣刚

（1.海南医学院第一附属医院，海南 海口 570102； 2.海南省人民医院，海南 海口 570102）

川芎主要成分为川芎嗪，具有活血行气、祛风止痛功效，临床多用于治疗瘀血阻滞的各种病症，称为“血中气药”[1]。细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞是新型免疫活性细胞，增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性，拟用于心血管、呼吸系统、消化系统及泌尿系统疾病的治疗[2-3]。本研究中分析了川芎嗪联合CIK细胞对裸鼠肝癌HepG2细胞的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞、仪器与试药

动物：裸鼠 46 只，雄性，（5.5±0.67）周龄，体质量175～225 g，由南华大学医学院动物实验中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK（湘）2004-0009。在无特殊病原菌条件下分笼饲养，自由进食、饮水，适宜温度、湿度，人工黑暗和光照交替。

细胞：HepG2细胞（上海纪宁实业有限公司）；PB003F-C单个核细胞（美国Allcells公司）。

仪器：HN-25S型CO2恒温培养箱（青岛聚创世纪环保科技有限公司）；IN Cell Analyzer 2500HS型高内涵细胞成像分析系统（美国 Molecular Devices公司）；xCELLigence RTCA SP型实时无标记细胞功能分析仪（美国 ACEA Biosciences公司）；LWD300-38LT型倒置生物显微镜（西安测维光电技术有限公司）。

试药：盐酸川芎嗪氯化钠注射液（湖南康都制药有限公司，国药准字H20041437，规格为每100 mL含盐酸川芎嗪40 mg）；细胞迁移分析试剂盒（美国Biovision公司，货号为K906-100）；DMEM培养基、胰蛋白酶及胎牛血清（美国Gibco公司）；4%多聚甲醛（美国Sigma公司）；注射用氨西林钠（湖南科伦制药有限公司，国药准字H43022217，规格为每支1.0g）；其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

HepG2细胞培养：将HepG2细胞接种于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养，壁贴，放置2～3 d。

CIK细胞培养：用完全培养液（100 mL／L胎牛血清，50 mg／L 注射用氨西林钠，10 mmol／L Hepes缓冲液，50 μmol／L 2-疏基乙醇）将外周血单个核细胞（PBMC）密度调至 1.5 ×109／L，在 CO2恒温培养箱中培养24 h，即得CIK细胞。

模型建立及分组、给药：取对数生长期的HepG2细胞进行试验。将HepG2细胞经0.25%胰蛋白酶消化后接种于裸鼠皮下，其消化过程为将无血清的DMEM培养液重悬细胞并接种于事先预备的孔板上，再将培养板置其上作用30 min后注入裸鼠皮下。建模成功后，按随机数字表法分为川芎嗪50 mg／L联合CIK细胞组（A组）、川芎嗪100 mg／L联合CIK细胞组（B组）和川芎嗪200 mg／L联合CIK细胞组（C组），各12只，灌胃给药3次，间隔8 h；经尾静脉一次性输注1.5×107个CIK细胞。另将10只建模成功裸鼠设为模型组（D组）。

1.3 观察指标

细胞侵袭和迁移能力：采用DMEM培养基调整细胞浓度后再次加入细胞悬液，培养24 h，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，重复2次，加4%多聚甲醛固定15 min，染色，显微镜下观察细胞迁移情况，并计算迁移抑制率。细胞迁移抑制率=（D组迁移或侵袭细胞数-用药组迁移或侵袭细胞数）／D组迁移或侵袭细胞数×100%。

基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）蛋白水平：采用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，采用Expo 32 ADC系统分析免疫荧光数据，结果均取平均值[4]。

细胞骨架蛋白-肌动蛋白微丝：采用IN Cell Analyzer 2500HS高内涵细胞成像分析系统检测，取消毒后的钛板，置一次性培养皿中，接种细胞悬液8 mL，培养后转至一次性培养皿中用PBS清洗，清洗2次后采用封闭液封闭60 min后染色，采用显微镜观察，采用Leica TCS软件测量视野中细胞的铺展面积。

1.4 统计学处理

采用SPSS22.0统计学软件分析。计量资料以表示，行t检验；计数资料以率（%）表示，行 χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞侵袭和迁移能力

与D组比较，B组和C组迁移和侵袭细胞显著减少，抑制率显著升高（P＜0.05）。详见表 1。随着时间的增加，A组、B组和C组细胞迁移数均明显低于D组，且C组＜B组＜A组，迁移率与时间及剂量呈正相关。详见图 1 和表 2。

表1 各组细胞侵袭和迁移能力比较（±s）

表1 各组细胞侵袭和迁移能力比较（±s）

注：与D组比较，#P＜0.05。下表同。

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表2 各组细胞侵袭情况比较（ ± s，个／视野）

表2 各组细胞侵袭情况比较（ ± s，个／视野）

组别A组B组C组D组质量浓度（mg／L）50 100 200 24 h 0.47±0.11 0.44±0.09 0.45±0.13 0.36±0.13 48 h 1.69±0.15#1.69±0.14#1.71±0.16#1.24±0.16 72 h 2.39±0.19#2.41±0.20#2.40±0.21#1.51±0.20

2.2 MMP-2和TIMP-2蛋白表达水平

与D组比较，A组、B组、C组细胞MMP-2蛋白表达显著降低，TIMP-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。详见表 3。

2.3 细胞骨架蛋白-肌动蛋白微丝

与D组比较，A组、B组、C组细胞骨架蛋白-肌动蛋白微丝面积显著缩小（P＜0.05）。详见表 3。

3 讨论

侵袭与转移是恶性肿瘤发展过程中的危险阶段，一旦出现将对预后造成严重影响[5]。细胞黏附性丧失及细胞骨架重建均会导致细胞运动和迁移[6-7]。川芎为无色针状结晶，对心脏、血管（尤其是冠状动脉）及脑部等部位病变有一定改善作用[8]。川芎嗪能抑制乳腺癌、肺癌细胞的体外增殖，作用机制为抑制肿瘤新生血管形成、抑制肿瘤细胞繁殖及逆转肿瘤细胞耐药性等[9]。CIK细胞是影响肿瘤的归巢能力及异常肿瘤微环境的重要因素[10]。

表3 各组细胞MMP-2蛋白和TIMP-2蛋白表达水平及细胞骨架蛋白-肌动蛋白微丝面积比较（±s）

表3 各组细胞MMP-2蛋白和TIMP-2蛋白表达水平及细胞骨架蛋白-肌动蛋白微丝面积比较（±s）

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本研究结果显示，随川芎嗪质量浓度的增加，HepG2细胞侵袭和迁移能力逐渐降低，且川芎嗪联合CIK细胞作用72 h后抑制细胞侵袭能力明显强于24 h后，说明川芎嗪可抑制HepG2细胞的迁移及侵袭，进而具有抗肿瘤转移作用。A组、B组、C组的MMP-2蛋白表达水平均明显低于D组，但TIMP-2蛋白表达水平均明显高于D组，显示MMP-2表达量降低时，TIMP-2表达量会随之升高。细胞骨架是由蛋白纤维交织而成的立体网架结构，并充满整个细胞质，细胞骨架与细胞膜及核膜存在结构联系，能保持细胞形状，且细胞骨架与细胞运动具有一定联系；微管、微丝和纤维是组成细胞骨架主要结构，微丝在肿瘤细胞中被修饰，与肿瘤细胞生长特点相关，而肌动蛋白是构成微丝的主要成分，在细胞迁移及侵袭中起至关重要的作用[11]。本研究中，A组、B组、C组裸鼠的细胞骨架蛋白-肌动蛋白微丝面积明显小于D组，川芎嗪联合CIK细胞能降低肝癌HepG2细胞骨架面积，可通过调节细胞松弛素达到减少微丝形成的目的，但川芎嗪联合CIK细胞是否可以获得新的间质表型仍有待研究。

综上所述，川芎嗪联合CIK细胞能抑制裸鼠HepG2细胞迁移及侵袭，作用机制可能与下调细胞MMP-2和上调TIMP2蛋白表达，以及抑制骨架微丝重排有关。