反相高效液相色谱法同时测定中成药保健食品中4种生育酚含量

张 竞，王雪芹，王 倩，徐金玲，王海波

（河南省食品药品检验所，河南 郑州 450003）

维生素E又称生育酚，为脂溶性维生素，具有抗氧化、抗衰老、促生育功能、提高免疫、保护肝脏、提高记忆、防治白内障、减轻肾损害等众多生理功能[1]。按其来源可分为人工合成和天然维生素E，来自动植物的天然维生素E是苯并二氢呋喃的衍生物，共有8种类似物，包括 α，β，γ，δ-生育酚和 α，β，γ，δ-生育三烯酚，生理活性均不同，其中以 α-生育酚生理活性最强，其次为 β-生育酚[2]。测定维生素E的传统方法主要有比色法、分光光度法、红外光谱法、荧光分析法、电化学法、气相色谱法等[3]，上述方法灵敏度和精密度均较低，准确性较差。高效液相色谱（HPLC）法的灵敏度、重复性、分辨率、分离效果均较好，本研究中参考文献[4-11]，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法对4种生育酚进行定量分析。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

e2695型高效液相色谱仪，包括2998型光电二极管阵列检测器（美国Waters公司）；XPE205型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XMTD-204型数显式电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.2 试药

安睡美胶囊（洛阳新春都生物制药有限公司，规格为每粒380 mg，样品Ⅰ）；玉妍丸（汉南汉方药业有限责任公司，规格为每粒0.14 g，样品Ⅱ）；α-生育酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号为190168-201601，含量为100.0%）、β-生育酚对照品（上海甄准生物科技有限公司，批号为 ZZS17121601，含量为96.0%）、γ-生育酚对照品（批号为 AC171010-12，含量为99.3%）、δ-生育酚对照品（批号为SM171007-28，含量为94.87%），均购自美国Stanford Analysis Chemicals公司；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：YMC Carotenoid-C30柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～13 min 时96%A，13～20 min时 96%A→100%A，20～24 min时100%A，24～24.5 min时 100%A→96%A，24.5～30 min时 96%A）；流速：0.8 mL／min；检测波长：294 nm；柱温：20 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

供试品溶液：取样品内容物适量，精密称定，置150mL锥形瓶中，加20 mL温水，混匀，再加1.0 g维生素C和0.1 g丁羟甲苯，混匀，加30 mL无水乙醇，15 mL氢氧化钾溶液（50 g→100 g），摇匀后于80℃恒温水浴振荡皂化30 min，立即冷却至室温；将皂化液用30 mL水转入250 mL分液漏斗中，加50 mL石油醚（30→60℃）-乙醚（1 ∶1，V／V）混合液，振荡萃取 5 min，将下层溶液转移至另一250 mL分液漏斗中，加入50 mL混合醚液再次萃取，合并醚层；用水洗涤至中性（约需3次，每次约30 mL）；将洗涤后的醚层经无水硫酸钠滤入旋转蒸发瓶中，用15 mL石油醚洗涤分液漏斗及无水硫酸钠洗涤2次，洗液并入蒸发瓶内，于40℃下，水浴充氮气蒸至近干；残渣用甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，定容，即得。

阴性对照品溶液：按样品处方和工艺制备缺天然维生素E的阴性样品，依法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：分别取2.2项下3种溶液各10μL，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图 1。结果理论板数按各待测成分峰计均大于9 000，分离度均大于1.5，基线分离良好。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密量取混合对照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得质量浓度分别为 5，10，20，40，60 μg／mL的系列溶液。精密量取10 μL，按拟订色谱条件进样，记录峰面积。以待测成分质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表 1。

表1 回归方程与线性范围（n=5）

精密度试验：取混合对照品溶液适量，按拟订色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果 α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚峰面积的RSD分别为 1.12%，0.93%，0.60%，1.21%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液（样品Ⅰ）适量，分别于室温下放置 0，2，4，6，8，12，24 h 时按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果 α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚峰面积的RSD分别为1.80%，0.93%，1.31%，1.74%（n=6），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：称取同一批样品（样品Ⅰ）适量，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定6次，记录峰面积，并计算含量。结果 α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚平均含量分别为2.59，0.82，20.36，8.70 mg／g，RSD分别为 1.33% ，1.81% ，1.90%，1.64%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品（样品Ⅰ）适量，共6份，分别加入低、中、高质量浓度的对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表 2。

2.4 样品含量测定

取各样品适量，精密称定，分别依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算含量。结果见表 3。

3 讨论

3.1 分析方法和色谱柱选择

表2 加样回收试验结果（n=6）

表3 样品含量测定结果（mg／g，n=3）

3.2 流动相选择

本试验中考察了纯甲醇和甲醇-水梯度洗脱2种流动相，纯甲醇作流动相时，4种生育酚不能有效分离，β-生育酚和-生育酚色谱峰重叠；甲醇-水梯度洗脱时，则既能让4种生育酚达到有效分离，又能防止其他脂溶性大分子杂质在色谱柱中的沉淀，延长了色谱柱的寿命。考察了 1.0，0.8，0.6 mL／min 3 种流速，流速越慢，各色谱峰分离效果越好，但样品保留时间则相对延长，检测灵敏度随之降低。对比后选则了0.8 mL／min为流速，在保证足够分离效果的前提下，使4种生育酚的保留时间控制在25 min以内，且峰宽适中。

3.3 不同样品生育酚含量分析

本试验中考察了2个不同厂家2个品种含天然维生素E的样品，2个样品中4种生育酚含量差异较大。维生素E中抗氧化作用最强的是 α-生育酚（活性为100%），然后是 β-生育酚（活性为 12% ～40%）、γ-生育酚（活性为3.0% ～20%）、δ-生育酚（活性为0.3% ～1.0%）。国际市场上，天然维生素E专门指活性最高的 α-生育酚，是从植物油加工副产物中提取纯化而来。但市场上的天然维生素E质量参差不齐，尤其是α-生育酚含量差异较大。为有效控制含天然维生素E类中成药和保健食品的质量，建议药品和保健食品生产企业进一步考察处方中所添加天然维生素E的化合物类型及合理的添加剂量。

综上所述，本研究中建立的方法操作简便，准确，精密度、稳定性、重复性、耐用性均较好，可用于同时测定中成药保健品中4种生育酚含量。