右归丸对肾虚脑缺血模型大鼠行为学的影响及机制研究*

张雨薇 王艳杰 张 博 尹丽丽 戴巧妹 刘 宏②* 黄树明

传统医学认为缺血性脑病的发生建立在肾虚的病理基础之上，亦开展了大量的从肾论治脑病的临床及实验研究[1]。多项研究结果显示，中医学益肾法对缺血性脑病显示良好的治疗效果，但其机制尚不清楚[2-5]。本研究采用永久性大脑中动脉阻塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)法和注射氢化可的松法建立脑缺血和肾虚模型，以雄性脑缺血模型大鼠为研究对象，采用传统滋阴补肾、填精益髓的经典方剂右归丸(YouGui Pill，YGP)进行干预，观察其对缺血后脑损伤的修复作用，并阐明其可能的作用机制，以期从分子生物学角度探讨中医学“益肾健脑”治则的神经生物学机制，为传统中医理论的现代科学解析及临床应用提供实验依据，并为临床缺血性脑病的治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

选用120只无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级SD雄性大鼠(由黑龙江中医药大学实验动物中心提供)，体重(250±20)g，所有动物均在温度为(25±1)℃，相对湿度为45%～50%的标准条件下饲养。将120只大鼠随机分为假手术组(sham operation group，SOG)，15只；单纯脑缺血组(simple cerebral ischemia group，SCIG)，21只；肾虚脑缺血组(renal asthenia cerebral ischemia group，RACIG)，21只；YGP低剂量组(YouGui pill low dose group，YGPLG)，21只；YGP高剂量组(YouGui pill high dose group，YGPHG)，21只；尼莫地平组(Nimodipine group，NpG)，21只。

1.2 实验药品与试剂

(1)实验药品:YGP由熟地黄24 g、山药(炒)12 g、山茱萸(微炒)9 g、枸杞(微炒)12 g、鹿角胶(炒珠)12 g、菟丝子12 g、杜仲(姜汤炒)12 g、当归9 g、肉桂6 g及制附子6 g的10味中药饮片组成，饮片购于北京同仁堂药店，由黑龙江中医药大学中医药研究院制备成水煎剂，置于冰箱中(4 ℃)备用。

(2)实验试剂:使用10%水合氯醛溶液、无菌生理盐水、75%医用酒精、青霉素钠粉剂、无水乙醇、95%乙醇、二甲苯、正丁醇、石蜡、苏木素、伊红、氧化汞、硫酸铝钾、蒸馏水、冰醋酸、氨水、甲苯胺蓝、中性树胶及稀盐酸等，氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、柠檬酸钠。

(3)生物试剂:兔抗大鼠Caspase-3抗体、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，Caspase-3抗体货号PB0813，DAB显色试剂盒货号AR1022。

1.3 模型制备方法

1.3.1 pMCAO大鼠模型制备

将各组大鼠进行如下操作:①大鼠的麻醉，使用10%水合氯醛溶液，以0.3～0.4 ml/100g的剂量腹腔注射[6]；②确定麻醉成功后固定、备皮及消毒手术区；③颈部正中做切口，钝性皮肤分离筋膜和肌肉组织，在气管深部找到右侧的颈动脉鞘；④小心游离出颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈外动脉(external carotid artery，ECA)及颈内动脉(internal carotid artery，ICA)；⑤结扎ECA根部及CCA近心端，血管夹夹住CCA远心端，虹膜剪剪一倾斜V型小口，将线栓自剪口处插入，固定好切口远端，松开血管夹，将鱼线通过ICA插至大脑中动脉开口处，至有阻力为止，根据实际情况决定是否需更换线栓；⑥手术完毕后清创、缝合并涂少量青霉素粉剂，预防感染。SOG大鼠除CCA不插入线栓，大鼠麻醉、固定、颈部手术、游离CCA过程均同SCIG大鼠。

1.3.2 肾虚大鼠模型制备

除SOG、SCIG外，其余各组大鼠每日上午同一时间点肌注氢化可的松注射液15 mg/kg，共14 d[7]。大鼠出现活动减少、畏寒喜暖、弓背蜷缩、食欲降低、反应迟钝、四肢消瘦、脱毛、多尿以及体质量降低等情况，表明肾阳虚大鼠模型造模成功[8]。

1.4 实验方法

1.4.1 生理盐水与YGP灌胃

(1)6组大鼠于术前3 d预先进行捉拿和生理盐水灌胃，以适应以后的捉拿及灌胃过程。于术前预先进行横木行走实验(beam walking test，BWT)训练7 d，去除本身有肢体障碍以及有视觉功能障碍的大鼠。术后24 h按照1次/d开始灌胃，每隔3 d重新称量大鼠体重，按体重调整给药剂量，连续灌胃14 d。SOG与SCIG大鼠灌胃等体积的生理盐水；YGPG大鼠灌胃YGP分别为5.13 g/kg和10.26 g/kg；NpG注射尼莫地平注射液0.7 mg/kg。给药后的3 d、7 d及14 d进行BWT，检测运动能力。行为学结束后，脑组织取材，尼氏染色法观察尼氏小体，免疫组化法检测Caspase-3的蛋白表达。

1.4.2 大鼠大脑皮质区神经元的尼氏小体

行为学结束后，脑组织取材。先将脑组织经先包埋过程制成蜡块，进行切片，其流程为洗涤→常规脱水→组织包埋→切片→捞片→烘片。将切片进行尼氏染色，常规脱蜡→染色:将切片浸入60 ℃、1%的甲苯胺蓝溶液中浸染30 min，自来水冲洗，脱水至透明后封片。光镜下观察大脑皮质区神经细胞尼氏体的情况，神经细胞胞浆中蓝色颗粒即为尼氏小体。

1.4.3 大鼠大脑皮质区Caspase-3的蛋白表达

免疫组化法检测大脑皮质区Caspase-3的蛋白表达[11]方法如下。

(1)标本制备:①取预先用石蜡包埋好的组织，经过轮转式切片机将组织按常规约4 µm厚度石蜡切片，然后经过漂片、捞片、烘片等工序，准备好切片；②常规脱蜡，用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各5 min，100%乙醇2 min、95%乙醇2 min、85%乙醇1 min和70%乙醇1 min，PBS冲洗3次，每次5 min；③用3%的过氧化氢(H2O2)灭活内源性过氧化物酶；④热修复抗原，将装有切片的柠檬酸缓冲液染色盒放入微波炉中，高火5 min，然后中火10 min，再高火5 min，完成修复后冷却至室温冲洗，冲洗后参照说明书滴加一抗(Caspase-3)，按照1∶50或1∶100比例进行稀释，放入湿盒内4 ℃过夜或者37 ℃放置1.5 h；⑤按照说明书滴加二抗(辣根酶标记山羊抗兔)IgG后，将其放入37 ℃电热温箱中30 min后冲洗；⑥使用二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色，取DAB染色液，将1 ml蒸馏水加入与试剂盒中的试剂A、B、C各一滴混匀，滴加到切片上，室温孵育8～15 min，镜下观察切片的显色反应，显色结束后用流水冲洗终止显色反应；⑦苏木素复染1 min，水洗；⑧梯度酒精脱水、透明后封片，待2 d充分干燥后光镜下观察数字成像记录。

(2)应用Image Pro Plus 6.0免疫组化分析软件进行累积光密度(integral optical density，IOD)法分析。

1.5 检测与评价指标

(1)神经功能缺陷评分:大鼠术后清醒状态下，参照Longa评分原则[9]评分，1～3分为造模成功，选择pMCAO造模成功的有效模型进行实验，在pMCAO造模后的3 d、7 d及14 d不同的时间点，进行BWT评分，以此评价各组大鼠精细运动的恢复情况。

(2)检测各组大鼠运动能力:于术后第3 d、7 d及14 d进行BWT，记录各时间点的评分，评价精细运动能力[10]。

1.6 统计学方法

应用SPSS 19.0统计分析软件，各组数据均以均值±标准差(x-±s)表示。多组数据差异性检验用单因素方差分析，组间均数两两比较应用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YGP对大鼠一般状态的影响

各缺血组大鼠与SOG比较，体重明显减轻，走路时步态摇晃，自主活动明显减少，毛发干枯杂乱，进食、饮水量明显较少，眼睑下垂，损伤侧眼分泌物明显增多；与各缺血组比较，YGPG大鼠状态明显改善。

2.2 各组大鼠运动能力检测结果

pMCAO术后2 h左右，大鼠开始清醒，pMCAO造模成功的大鼠表现出明显的运动障碍。pMCAO造模3 d后，SCIG大鼠与SOG比较，BWT评分显著降低，其差异有统计学意义(t=7.86，P＜0.01)，表明大脑中动脉阻塞造成了大鼠精细运动出现障碍；RACIG与SCIG比较，大鼠BWT评分显著降低，其差异有统计学意义(t=3.61，P＜0.05)，表明肾虚和大脑中动脉阻塞同时发生，大鼠精细运动障碍加重；YGPG及NpG与RACIG比较，大鼠BWT评分升高。pMCAO造模后7 d与3 d比较，SOG大鼠BWT评分无明显变化，缺血组大鼠的BWT评分升高，表明运动功能开始恢复。pMCAO造模后7 d，SCIG与SOG比较，大鼠BWT评分显著降低，其差异有统计学意义(t=8.40，P＜0.01)；与RACIG相比，YGPG(即YGPLG及YGPHG)大鼠BWT评分显著升高，其差异有统计学意义(t=4.59，t=5.46；P＜0.01)(高剂量组P＜0.01，低剂量组P＜0.05)，但仍较SOG降低，表明YGP能够促进缺血后运动功能的恢复，但是用药时程短，药效尚未完全发挥。pMCAO造模后14 d与7 d比较，各组BWT评分明显升高。SCIG与SOG比较，BWT评分仍然低于SOG，其差异有统计学意义(t=5.33，P＜0.01)；YGPLG、YGPHG与RACIG比较，BWT评分明显升高，其差异有统计学意义(t=2.67，t=3.02；P＜0.01)，见表1。

2.3 尼氏染色结果

SOG大鼠尼氏染色为清晰的蓝色块状，皮质区神经细胞轮廓清晰完整，细胞内尼氏体较丰富，各缺血组大鼠与SOG比较，皮质半暗带区细胞排列松散，大量神经元消失，残存的神经元胞核固缩，尼氏体明显减少；RACIG与SCIG比较，神经元损伤明显加重，尼氏体严重减少；YGPHG与RACIG比较，神经损伤

表1 各组大鼠BWT评分比较(x-±s)

图1 各组大鼠脑皮质区尼氏小体(尼氏染色，×100)

2.4 各组大鼠皮质区Caspase-3表达检测

各组大鼠DAB染色，光镜下观察到Caspase-3表达于皮质和海马区的神经元，选择右侧皮质区进行测量。DAB染色阳性细胞的胞浆、胞核内呈棕黄色及黄褐色颗粒。而用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)替代一抗孵育的阴性，切片着色非常浅或不着色。Caspase-3的蛋白表达量越多，颜色越深。Caspase-3的蛋白表达结果显示:SOG大鼠Caspase-3的蛋白表达较弱，IOD较小；SCIG与SOG相比，大鼠Caspase-3的蛋白表达明显上调，其差异有统计学意义(t=10.38，P＜0.01)；RACIG与SCIG相比，大鼠Caspase-3的表达明显增多，其差异有统计学意义(t=13.84，P＜0.01)；YGPHG与RACIG相比， 大鼠缺血皮质区的Caspase-3的蛋白表达均明显下调，其差异有统计学意义(t=6.97，P＜0.01)，见表2和图2。

3 讨论

近年来，缺血性脑血管病的发病出现逐年攀升和日趋年轻化的令人担忧趋势，尤其继发于该病的致死、致残及复发率极高严重困扰世界，该病已经成为急待解决的社会问题。因此，迫切需要找到治疗和预防缺血性脑血管疾病的有效措施。目前，缺血性脑血管病的治疗方法仍然很有限，现代医学尚无良好的防治对策。传统医学认为，缺血性脑血管病的发生与“肾精亏虚”密切相关。益肾治则是根据传统中医理论制定的临床预防和治疗脑部疾病的最重要、最基本的治则，对于缺血性脑病如脑梗死等展现出不容置疑的治疗效果。但是迄今为止，“益肾健脑”治则的神经生物学机制尚未完全明了，因而本研究中将肾虚脑缺血损伤同时发生与单纯脑缺血损伤进行对比，其结果显示，肾虚可明显加重脑损伤；选取补肾的经典方剂YGP作为治疗药物对脑缺血进行干预，其结果显示，YGP对缺血后脑损伤具有一定的修复作用。在此结果基础上，进一步探究YGP发挥作用的分子机制。

表2 各组大鼠皮质区Caspase-3的IOD

图2 各组大鼠脑皮质区Caspase-3的表达(DAB，×200)

本研究采用被广泛公认、可有效模拟人类缺血性脑血管病理生理过程的pMCAO法建立脑缺血模型。pMCAO术后，造成大鼠大脑中动脉供应的皮质脑区出现损伤，皮质区与机体的运动功能密切相关，因而大鼠出现精细运动功能的障碍，表现出与临床上缺血性中风症状相似的行为学改变。BWT被广泛用以检测大鼠的运动协调能力，作为评价缺血后脑损伤程度及观察药物疗效的重要指征。本研究中大鼠BWT评分显示，缺血后运动评分降低，精细运动能力减弱；肾虚与脑缺血同时发生时，BWT评分较单纯缺血明显降低，动物运动障碍亦更加明显，表明肾虚可加重脑缺血损伤。YGP干预后，BWT评分升高，运动障碍明显改善，提示YGP可对抗缺血后脑损伤。

为探究运动障碍的原因所在，本研究采用尼氏染色技术进一步从微观上进行直观的形态学观察加以印证。结果显示，pMCAO造成的缺血梗死灶出现在皮层下或者纹状体区，梗死中心区细胞变性坏死，因而淡染偏于白色，梗死半暗带细胞丢失严重，排列紊乱，水肿现象明显，同时尼氏小体数量减少，表明缺血对脑组织造成了形态和功能上的损伤性改变。肾虚后脑组织形态和功能上损伤明显加重，而YGP治疗后，损伤明显改善，由此从形态学上证实YGP对缺血性脑损伤有确切的治疗作用。

近年的研究表明，缺血后脑损伤的发生是氨基酸的兴奋毒性、能量代谢障碍、自由基的产生、钙超载、炎性反应及凋亡等诸多因素综合引起的级联反应[12]。缺血半暗带区神经细胞凋亡在缺血损伤中的作用日益受到重视，抗凋亡治疗途径成为保护缺血脑组织的新切入点。凋亡过程的启动是在多种复杂因素的调节下发生，凋亡过程主要通过线粒体和死亡受体通路被启动，通路上的促凋亡及抑凋亡基因双重调控着凋亡过程[13]。Caspase家族作为凋亡的启动者和执行者作用关键，而Caspase-3是家族成员中触发级联反应的枢纽[14]。因此，本研究选择Caspase-3为切入点进行研究，其结果显示，大鼠缺血后皮质区Caspase-3蛋白表达明显增加，与苗光新等[15]的研究结果一致，而YGP可使上调的Caspase-3蛋白表达明显下降。

本实验研究从大鼠的行为学、形态学以分子生物学实验上的逐级相互补充印证，证实补肾方剂YGP不失为治疗缺血后脑损伤的良方，亦证实其发挥脑保护作用的可能机制之一是抑制缺血半暗带区神经细胞的凋亡过程。YGP发挥脑保护作用的其他可能机制，尚需进一步的研究。