磁敏免疫法检测降钙素原的性能评估*

何洁静 邹秀敏 吕 杨

降钙素原(procalcitonin，PCT)是降钙素的多肽前体，正常情况下PCT产生于甲状腺C细胞染色体11上的Calc-1基因。由于在甲状腺C细胞中产生的PCT绝大多数转化成降钙素，因此在健康人体内PCT的含量非常低(＜0.05 ng/ml)[1]。PCT在全身炎症反应后的2～4 h时开始升高，12～24 h达到峰值[2]。PCT在血样中非常稳定，采血后在室温下放置24 h，PCT质量浓度仅下降12%左右，如果在4 ℃保存仅下降6%。冰冻、抗凝剂、血清或者血浆、动脉血或者静脉血对检测结果的影响均微乎其微。PCT对于感染早期的诊断、感染类型的鉴别和程度的判定、感染疾病的分层治疗和预后评估以及指导抗生素使用等方面有很高的价值[3-8]。

即时检测(point of care testing，POCT)设备因为体积很小，便于携带，操作方式简单，检测结果即时显示，为诊断和治疗节省了宝贵的时间，从而降低患者致残率和病死率，可以在各种复杂环境下例如救护车内、急诊室、患者家中甚至偏远户外使用[9-10]。

近年来，POCT是体外诊断行业增长最为快速的分支，目前市场上能够检测PCT的POCT产品很多，其主流的方法学有免疫荧光分析法、胶体金免疫层析法和基于微流控芯片的磁敏免疫法等[11-14]。其中磁敏免疫法运用了磁敏生物芯片及主动微流控两大关键技术，实现高精度的检测，文章参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)EP17-A文件的要求，对磁敏免疫分析仪及其配套PCT检测试剂进行最低检出限、准确度、精密性、线性范围、抗干扰性及方法学比对评估。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

(1)Cobas e411电化学发光全自动免疫分析仪(罗氏公司，以下简称罗氏e411)；m16磁敏免疫分析仪(深圳市理邦精密仪器股份有限公司，以下简称理邦m16)。

(2)降钙素原检测试剂盒(电化学发光法)，100测试/盒，批号23285903；降钙素原测定试剂盒(磁敏免疫法)，25人份/盒，批号20180523。

1.2 检测标本

收集2018年5-6月解放军联勤保障部队第928医院64份临床背景清晰的门诊及住院患者4 h内采集的新鲜血清标本，包含不同浓度梯度，用于方法学比对评估。

1.3 检测方法

磁敏免疫法的检测。结合链霉亲和素-生物素体系的双抗体夹心免疫反应，将PCT抗体包被在巨磁阻芯片上，进行包被抗体→样本抗原→标记抗体的夹心反应，标记抗体上修饰有生物素，可以与结合了链霉亲和素的超顺磁纳米颗粒反应，磁颗粒被固定在芯片表面，利用磁敏传感器对芯片上磁颗粒产生的磁信号进行检测，根据磁信号的强弱判断样本中PCT抗原的含量。

1.4 主要分析参数

(1)最低检出限评价。最低检测限(limit of detection，LoD)，参考EP17-A文件[15]在磁敏免疫分析仪上对空白样本进行检测，测定20次，得到20次测试结果，计算其平均值(MB)和标准差(SDB)，空白限(limit of blank， LoB)=MB+1.645 SDB，计算出LoB。采用PCT标准抗原，用空白样本稀释配制5份浓度近似检出限的低值样本，对5份浓度近似检出限的低值样本进行检测，每份样本测定5次，对检测结果按照大小进行排序，计算Cβ和标准差(SDS)，最低LoD=LoB+Cβ·SDS，计算出最低LoD，如果低值样本测定的所有25个结果中小于空白限LoB的数目≤3个，认为检出限和空白限的设置合理。定量检出限(limit of quantity， LoQ)定义为样品中可以准确定量测定的最低分析物浓度，参照EP17-A文件将检测样本(0.1 ng/mL)做系列稀释后的低值样品，连续测定25次，评估系统偏倚应不高于指定偏倚±15%，精密度(CV)＜15%。。

(2)准确度评价。参考EP15-A2文件[16]采用PCT标准抗原，用阴性样本分别稀释至0.5 ng/ml、2 ng/ml和30 ng/ml，对同一样品作双份测量，共做5 d。计算95%置信区间(confidence interval，95%CI)的验证区间，如果验证区间包括标示值，则验证通过。

(3)精密性评价。参考EP5-A2文件[17]采用PCT标准抗原，用阴性样本分别稀释至0.5 ng/ml和5 ng/ml，每日进行2个批次的测试，每批测试时对同一样品作双份测量，共进行20 d。评估结束时共有40对，即80个测试结果，计算批内精密度和批间精密度。

(4)线性范围评价。参考EP6-A文件[18]将高、低值样本按比例混合，得浓度分别为0.01 ng/ml、0.5 ng/ml、2 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml的5个浓度水平的线性范围验证样本，对每份样本平行测定4次，对测试值和理论值进行线性回归分析。

(5)抗干扰能力评价。参考文件EP7-A2文件[19]评估的干扰物为血红蛋白、胆红素、甘油三脂、生物素、类风湿因子、嗜异性抗体和人抗动物抗体等7种。选择两个不同浓度水平的样本作为基础样本，向基础样品溶液中添加不同浓度的干扰物评估其对PCT检测的影响。

(6)方法学比对。参考文件EP9-A2文件[20]对64份临床血清样本分别用理邦m16磁敏免疫分析系统、罗氏e411电化学发光系统定量检测PCT，以检验科罗氏测试结果为参照，分别进行相关、回归、偏差及一致性分析。

1.5 方法学比对评价

针对两种检测体系的结果，以罗氏e411电化学发光系统结果为对照，分别采用相关、直线回归、Bland-Altman差异分析和一致性分析等方法进行统计分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0和Medcalc15.2.2软件进行统计学分析。计算计量资料统计均数、方差、标准差和精密度，线性范围采用最小二乘法线性回归；两种定量测定结果之间的相关性分析采用Pearson相关分析(或Spearman rank相关分析)；回归分析运用Passing-Bablok直线回归分析，系统间差异性分析用Bland-Altman分析，阴阳一致性采用四表格法统计，计算阴性、阳性符合率并进行Kappa检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 最低LoD验证

最低LoD验证结果显示，理邦m16磁敏免疫分析仪检测PCT的LoB=MB+1.645 SDB(其中，MB为20次空白样本检测均值，SDB为空白样本检测标准差)，LoB计算值为0.005 ng/ml。通过对5份浓度近似LoD的低值样本进行检测，最低LoD=LoB+Cβ×SDS(其中，SDS为多个低浓度样品的综合标准差，Cβ为标准正态分布第95%百分位数值的校正因子，Cβ=1.645/(1-1/4f)，f为SDS的自由度)，LoD计算值为0.008 ng/ml，符合厂商声称的最低LoD标准，低值样本测定的所有25个结果中小于LoB的数目＜3个，认为检出限和LoB的设置合理。

LoQ研究结果显示，通过对系列浓度的样本测定，样本浓度达到0.06 ng/ml时，系统的准确度偏差为13.2%，小于厂商规定的偏倚±15%；精密度为14.6%，小于厂商声称的精密度≤15%，因此LoQ为0.06 ng/ml。

2.2 准确度验证

准确度验证结果显示，系统对PCT项目的检测低、中、高(浓度分别为0.5 ng/ml、2 ng/ml和30 ng/ml)水平的各10次检测，验证区间分别为0.42～0.57 ng/ml、1.79～2.25 ng/ml(27.4～32.1 ng/ml，标示值0.5 ng/ml、2 ng/ml和30 ng/ml均包含在验证区间内，符合厂商声称的要求，准确度可靠。

2.3 精密度验证

同一组操作者在磁敏免疫分析仪上对PCT浓度分别为0.5 ng/ml和5 ng/ml的样本进行重复测定，每日进行2个批次的测试，每批测试时，对同一样品作双份测量，持续进行20 d检测，0.5 ng/ml水平下PCT的批内精密度为5.65%，批间精密度为6.41%；5 ng/ml水平下，PCT的批内精密度为4.77%，批间精密度为5.46%，精密度满足临床要求。

2.4 线性范围验证

在0.01～50 ng/ml范围内，经相关性分析得相关系数r＞0.99(P＜0.0001)，PCT实测值与理论值呈显著正相关；回归方程为Y=0.9785X+0.0506，R2＞0.99，斜率b的95%置信区间为0.9724～0.9845，截距a的95%CI为-0.0874～0.1888，与0的差异检验无统计学意义(t=1.1676，P=0.3273)，与说明书描述的线性范围0.01～50 ng/ml相符，验证合格。

2.5 抗干扰能力评价

干扰试验验证结果表明:血红蛋白对试剂盒的干扰浓度临界值为5000 mg/dl；胆红素对试剂盒的干扰浓度临界值为15 mg/dl；甘油三脂对试剂盒的干扰浓度临界值为3000 mg/dl；类风湿因子对试剂盒的干扰浓度临界值为200 IU/ml；噬异性抗体对试剂盒的干扰浓度临界值为抗体滴度1:64；生物素对试剂盒的干扰浓度临界值为10 mg/dl；人抗鼠抗体对试剂盒的干扰浓度临界值为50 pg/ml，低于上述临界值时不会对检测值产生显著干扰。

2.6 相关分析

磁敏免疫法(理邦m16)检测PCT的结果与对照结果相关系数＞0.9，其中理邦m16系统与对照的相关系数＞0.99。相关性结果见表1。

表1 理邦m16与罗氏e411测定结果相关分析

2.7 回归分析

线性回归方程为Y=-0.006+0.993X，二系统的决定系数＞0.99。线性回归结果见表2，回归直线见图1。

图1 两系统测定结果回归直线及散点图

2.8 Bland-Altman差异分析

理邦m16系统样本浓度测试结果与对照结果相对偏差的一致性界限(limit of agreement，LoA)为[-25，19.0]，LoA下限-25的95%CI为[-29.9～20.1]，上限19.0的95%CI为[14.1～23.9]，综合的LoA为[-29.9，23.9]，平均偏差为-3.0%，最大偏差＜±30%，满足血清降钙素原室间质评±30%的要求。Bland-Altman差异分析结果见表3、图2。

表2 两系统测定结果回归分析统计

表3 两系统测定结果的Bland-Altman分析统计

图2 两系统测定结果的Bland-Altman图

2.9 一致性分析

根据PCT急诊临床应用的专家共识[21]分别评价Cut-off值为0.5 ng/ml和2 ng/ml的一致性，一致性分析结果见表4(a)、(b)。

表4 (a)两系统一致性结果统计表

阳性符合率:100.00%；95%CI:93.00%～100.00%；阴性符合率:100.00%；95%CI:77.19%～100.00%；总一致率为100.00%；95%CI:94.34%～100.00%。

表4 (b)两系统一致性结果统计表

阳性符合率:100.00%；95%CI:86.21%～100.00%；阴性符合率:100.00%；95%CI:91.24%～100.00%；总一致率为100.00%；95%CI:94.34%～100.00%。

在cut-off值0.5 ng/ml处，理邦m16与对照系统的阴、阳性符合率均为为100%，Kappa值分别为1；在2 ng/ml处，理邦m16与对照系统的阴、阳性符合率均为100%，Kappa值分别为1。两POCT系统在cutoff值0.5 ng/ml和5 ng/ml处均具有良好的一致性。

2.1 0 医学决定处水平的偏倚分析

在医学决定处水平0.5 ng/ml、2 ng/ml处，利用回归方程计算试验系统与对照系统的预期偏倚Bc=a+(b-1)Xc，相对偏差=Bc/Xc。在0.5 ng/ml处，理邦m16与罗氏e411结果之间预期偏倚Bc为0.01，Bc95%CI为[-0.109～0.127]，相对偏差为2%；在2 ng/ml处，预期偏倚Bc为-0.02，95%CI为[-0.091～0.129]，相对偏差为-1%，均符合血清PCT室间质评中的±30%要求。

3 讨论

PCT作为重要的全身炎症反应和细菌感染的指标，特异性强、敏感性维持时间长，随着感染的消除逐渐下降而非常适用于临床[22]。PCT的使用为临床医生提供简单、有效的鉴别感染类型的方法，避免延误患者治疗，同时在减少抗菌药物用量、缩短抗感染疗程方面也发挥重要作用。临床检验PCT使用的分析设备应具备实用性和可靠性，理邦m16磁敏免疫分析系统是基于巨磁阻芯片和主动微流控生物芯片的新一代POCT设备，具有准确度高、重复性好和高灵敏的特点，同时采用人性化POCT便携式设计，操作简单，适合在临床多个科室使用。根据国际标准化组织(International Organization for Standardization，ISO)15189“医学实验室质量和能力的专用要求”的规定，设备性能需满足规定的标准[23]。

本研究显示，磁敏免疫法定量检测3个浓度水平的PCT的测试结果的验证区间包含理论值，准确度可靠。最低检出限验证结果显示，实验系统检测PCT的检出限LoD为0.008 ng/ml，低值样本测定的所有25个结果中小于LoB的数目＜3个，LoD和LoB的设置合理；定量检测限验证结果显示，当样本浓度为0.06 ng/ml时，检测结果的偏差和精密度满足要求。精密度评估结果显示，在浓度水平为0.5 ng/ml和5 ng/ml时，PCT检测批内和批间精密度均＜10%，满足临床检测的要求。线性范围的评估结果显示，在0.01～50 ng/ml范围内线性度良好。干扰试验验证结果表明:血红蛋白浓度5000 mg/dl、胆红素浓度15 mg/dl、甘油三脂浓度3000 mg/dl、类风湿因子浓度200 IU/ml、噬异性抗体滴度1∶64、生物素浓度10 mg/dl、人抗鼠抗体浓度50 pg/ml时，检测结果偏差＜15%，干扰物低于上述临界值时不会对检测结果产生显著干扰。

方法学比对结果显示，理邦m16系统检测64例临床血清样本与市场反馈良好的罗氏e411及配套试剂盒检测结果显著相关(rp＞0.975)，线性回归方程为Y=-0.006+0.993X(R2=0.997)；医学决定水平0.5 ng/ml和2 ng/ml处的预期偏倚Bc分别为0.01 ng/ml和-0.02 ng/ml，相对偏倚小于卫生部临床检验中心室间质量评价中PCT规定的30%的标准，满足临床要求。Bland-Altman差异分析显示，两系统相对偏差一致性界限LoA为[-29.9，23.9]，两系统结果总体平均偏差-3.0%，100%点位于一致性范围内。一致性分析结果显示，两系统阴阳性符合率及总符合率较高，kappa值＞0.75，认为两系统等效。以罗氏e411为参照，理邦m16检测体系检测PCT的临床性能在相关性、准确度及一致性方面与参照系统相当，具有很好的临床应用价值。

磁敏免疫法检测PCT的方法学性能良好，符合有关文件的规定和要求，能为临床快速提供准确、可靠的检验结果，满足临床需要。