合欢磁牡口服液提取工艺研究

罗永祥许加娟胡智鹏

（1．湖南圣雅凯院士工作站，湖南湘潭411228；2．湖南圣雅凯生物科技有限公司，湖南湘潭411228）

近年来，我国家禽集约化、规模化养殖发展迅速，但各种应激因素对家禽造成的危害却并没有得到解决，如免疫接种、转群换料以及长途运输等所致的应激刺激是不可避免的。由此造成家禽生长缓慢，采食量降低，饲料转化率下降，更甚者导致机体免疫功能下降，传染病流行。如今，越来越多研究将中药复方制剂和应激联系起来，中药复方制剂也逐渐替代西药应用于家禽养殖生产中［1］。合欢磁牡口服液是由合欢皮、磁石和牡蛎经一定工艺制成，用于缓解家禽抗应急反应的一个纯中药制剂，其中，合欢皮解郁安神做君药，磁石、牡蛎镇心安神辅佐合欢皮镇静安神。三药合用，经口服，药物直接作用于脾胃、肠道，并经胃肠道吸收，可有效缓解应激原所引起的躁动不安，心神不宁等应激反应，避免家禽许多潜在疾病的发生［2-3］。因此，最佳的提取工艺是有效控制合欢磁牡口服液产品质量的重要保证。

1 材料与方法

1．1 药物 合欢皮、磁石、牡蛎均购于湖南湘众医药有限公司，合欢磁牡口服液由湖南圣雅凯生物科技有限公司制备。

1．2 对照品与试剂 （-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（C33H44O17）购自中国食品药品检定研究院，供含量用，批号：111911-201603；乙腈，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；磷酸，分析纯，天津市光复精细化工研究所。

1．3 主要仪器与设备 水环式真空旋转蒸发仪，北京；电子天平（日本岛津AUW220D）；高效液相6000 LDI PUMP（美国）检测器型号：紫外；色谱柱：Uranus，C18 5 μm 4．6 mm×250 mm；色谱条件：18／82 乙腈／0．04%磷酸溶液；多功能提取罐购自湖南衡阳中一药品机械有限公司；真空浓缩罐购自浙江温州森博轻工机械有限公司；口服液配制罐购自浙江温州标新机械有限公司；口服液灌装机购自湖南长沙中和药品机械有限公司。

1．4 方法

1．4．1 组方 合欢皮500 g、磁石250 g、牡蛎250 g，制成1000 mL。即每毫升含1 g 原生药材。

1．4．2 水提工艺的研究 C33H44O17为合欢皮主要成分，故以测定C33H44O17含量为考察指标，用正交设计法筛选加水量、煎煮时间、煎煮次数等工艺条件。采用L9（34）进行正交试验［4-5］。因素水平安排见表1：

表1 L9（34）正交试验因素水平Tab 1 Level of L9（34） Orthogonal Experimental Factors

1．4．3 浓缩工艺的研究 提取按确定的生产工艺，浓缩采用单因素工艺研究，故选择在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃（控制适宜的真空度）工艺条件下各浓缩3 批次至相对密度为1．04～1．06（60-70 ℃），加防腐剂羟苯甲脂+羟苯丙脂（9 ∶1）适量，加纯化水配制成合欢磁牡口服液，每批平行测定C33H44O17含量［6］，求得平均值和RSD，考察浓缩温度对合欢磁牡口服液C33H44O17含量的影响。

1．4．4 提取工艺验证试验［7-8］按最佳工艺连续生产10 批，以C33H44O17含量为考察项目。制定合欢磁牡口服液C33H44O17含量指标。

1．5 统计分析 使用Excel 数据库记录数据，并使用SPSS19．0 分析软件（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）进行统计分析。显著性水平为P＜0．05或P＜0．01。

2 结果与分析

2．1 提取工艺正交试验 由表2极差R 的数据分析可知：各因素的影响程度依次为C＞A＞B，即煎煮次数＞加水倍数＞煎煮时间。由表3方差分析结果表明：影响因素煎煮次数C 对产品中C33H44O17含量有显著影响（P＜0．01），煎煮次数为C3 时C33H44O17含量最高；煎煮时间B 和加水量A 对产品中C33H44O17含量无显著影响（P＞0．05）。

2．2 浓缩工艺研究 表4结果显示，不同的浓缩温度对合欢磁牡口服液中C33H44O17含量的无显著影响（P＞0．05）。

表2 合欢磁牡口服液提取工艺正交试验及结果Tab 2 Orthogonal experimental and results of extraction process of Hehuacimu oral liquid

表3 正交试验方差分析Tab 3 Variance analysis of orthogonal experiment

表4 不同浓缩温度对合欢磁牡口服液含量的影响Tab 4 Effects of different concentrated temperature on the content of Hehuacimu oral liquid

2．3 水提取工艺验证 根据以上提取和浓缩工艺的试验研究结果，最终采用加8 倍量的水，煎煮时间1 h，煎煮3 次，真空浓缩的工艺进行水提取工艺验证试验。结果见表5。结果显示，采用该工艺提取的C33H44O17的转移率平均值为72．37%，RSD为0．83%，对C33H44O17含量无显著影响（P＞0．05）。

表5 水提取工艺验证试验结果Tab 5 Verification experimental results of water extraction process

3 讨论与结论

《神农本草经》描述合欢皮作用：“主安五脏，和心志，令人欢乐无忧。”中医药理论将合欢皮归为安神药物，现代药物书籍将合欢皮归类安神药。合欢皮为合欢磁牡口服液方中君药，其主要成分为三萜皂苷、生物碱、黄酮类、木脂素和多糖等多类化学成分［9］。现代药理学研究结果表明，水溶性的木脂素类成分为合欢皮解忧安神作用的主要活性成分［10］。夏洁等人［11］研究结果显示，通过活性筛选实验，发现合欢皮的安神作用与合欢皮中具有镇静功能的活性成份木脂素类化合物有关，其中木脂素苷的含量最高。《中国兽药典》2015年版中合欢皮项下的含量测定以C33H44O17为质量考察指标。故本次试验选择C33H44O17含量测定作为产品质量考察指标。

木脂素是由苯丙素氧化聚合而成的一类化合物。多数呈游离状态，游离的木脂素亲脂性强，水溶性差。从分子结构上分析C33H44O17中连接了吡喃葡萄糖苷结构，由于葡萄糖是多羟基醛单糖，木脂素苷类水溶性大大增强，C33H44O17易溶于水，水是易得且价格低廉的溶剂，故选择水作溶剂。本水提取工艺试验结果表明，影响因素煎煮次数对合欢磁牡口服液的提取工艺影响显著，选择煎煮3 次时，C33H44O17的含量显著升高，因此最佳参数为煎煮3 次；加水量和煎煮时间对提取工艺的影响不显著，但从经济角度考虑，选择加8 倍量的水，煎煮1 h。不同的浓缩温度对合欢磁牡口服液含量的影响无显著差异。然而，考虑到真空浓缩过程中药物处于密闭设备中，无外界污染风险，故将浓缩工艺确定为真空浓缩。采用本试验总结出的此最佳工艺C33H44O17的转移率平均值为72．37%，RSD为0．83%，对10 个批次的C33H44O17含量影响的差异不显著，提示此工艺的重现性较好，工艺稳定。

合欢磁牡口服液标准草案中含量测定规定：合欢磁牡口服液每毫升含合欢皮以C33H44O17计，不得低于140 μg。此含量是依照《中国兽药典》2015年版合欢皮质量标准和道地药材合欢皮企业内控技术要求，且结合本工艺活性成分C33H44O17转移率制定。这也提示合欢磁牡口服液中标准C33H44O17含量定量基本合理。本试验水提取工艺验证结果显示，10 个批次的产品中每毫升含合欢皮以C33H44O17计的含量都远远高于140 μg，证明本工艺质量可控，为制定标准定量指标提供可靠依据，建议在取得新兽药证书及生产批件后，收集道地药材合欢皮C33H44O17含量数据，制定更高的合欢皮企业内控标准，为提升产品质量内控标准提供依据。

合欢磁牡口服液中C33H44O17含量的检测结果在前后试验中出现一定偏差，主要是由于不同产地的合欢皮中C33H44O17含量差距较大。通过数据分析得出，2017年试验结果显示C33H44O17转移率为71．96%，与之前的转移率72．37%比较，偏差较小。这也表明了此提取合欢磁牡口服液的工艺重现性好，工艺稳定的优点。

磁石为镇静安神类矿物性中药，始载于《神农本草经》，历代中医文献记载，磁石“主周痹风湿、肢节肿痛、通关节、消痛肿、明目聪耳、止金疮血、治金疮肿毒、敛汗止血。”。其系主含四氧化三铁，具有聪耳明目，潜阳纳气和镇静安神的作用，用于治疗头晕目眩、肾虚气喘等证。牡蛎也首载于《神农本草经》，书中将其列为上品。其中记有“牡蛎，味咸平，主伤寒寒热，温疟洒洒，惊恚怒气，除拘缓鼠瘘，女子带下赤白，久服，强骨节，杀邪气，延年。”至汉代，张仲景所著《伤寒论》和《金匮要略》就已经广泛的使用牡蛎组成方剂来治疗疾病。两书中涉及到配伍牡蛎的方剂就达11 个之多，主要口服汤剂给药。《中国兽药典》和《中国兽药典兽药使用指南》中药卷均有收载［12-13］。以上著作都不同程度上体现了牡蛎在中医临床上的重要的地位。近代研究还表明，牡蛎可以调节人体免疫水平，可降血脂和血压。我们曾对磁石和牡蛎成分的提取进行研究，结果不理想，有待进一步研究。