9个产地6种杨树花中水杨苷含量测定方法的优化及其分布研究

邱天宝，郝 哲，李华岑，刘素梅，韩 立

（1．河南省兽药饲料监察所，郑州450008；2．解放军第九八八医院，郑州450042）

杨树花收载于《中国兽药典》2015年版二部，具有清热解毒，化湿止痢［1-3］的功效，主治湿热下痢，幼畜泄泻。杨树花的水煮液治疗人和家畜的各类细菌性痢疾和肠炎［4］，对多种肠道细菌都有杀灭或抑制作用［5］，临床效果良好，同时具有明显的抗肿瘤、解热镇痛和抗风湿作用［6-7］。其中以水杨苷为代表的苷类化合物具有解热、镇痛作用［8-9］，药用开发价值较高。杨树花是常用兽药，具有分布广泛，价格低廉，疗效确切等优点，深受养殖户青睐，有广阔的市场开发前景。目前杨树花药材的质量控制仅有理化鉴别和薄层鉴别，缺少对其品质的评价标准，本试验对9 个产地6 种杨树花中水杨苷的含量测方法进行了系统研究，为杨树花质量标准的提升及品质评价提供了科学依据，具有很高的参考价值。

1 仪器与试药

1．1 仪器 Waters2695 高效液相色谱仪，2998PDA检测器（美国Waters 公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER-AE240 型电子分析天平；移液器（德国eppendorf 公司）。超纯水系统Mili-QAdvantageA10（美国MILLIPORE 密理博）。

1．2 试剂与对照品 水杨苷对照品（含量98．0%，批号4．530013．0001，ANPEL Scientific instrument Co．．Ltd．），乙腈为色谱纯（默克股份两合公司），甲醇为色谱纯（默克股份两合公司），水为娃哈哈纯净水经超纯水系统制备，其余试剂均为分析纯。

1．3 药材 杨树花于2018年4-6月采集，品种经河南省林科院鉴定，结果见表1。

2 方法与结果

2．1 色谱条件 Waters XBrigeTMC18 柱（4．6 mm×150 mm，5 μm），流动相为水-甲醇-乙腈（92 ∶4 ∶4）；流速1．0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长267 nm；进样体积10 μL。

表1 杨树花产地及品种Tab 1 Origin and varieties of poplar flowers

2．2 对照品溶液的制备 水杨苷对照品溶液制备：取水杨苷对照品约10 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。

2．3 供试品溶液的制备 取样品粉末0．5 g，精密称定，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量；回流提取30 min，放至室温，用50%甲醇补足重量，滤过，取续滤液，经0．45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2．4 线性范围 取水杨苷对照品约10 mg，精密称定，置25 mL 量瓶中加甲醇稀释至刻度作为储备液，分别精密吸取水杨苷对照品储备溶液1、2、3、4、5 mL 置10 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度。照“2．1”项下色谱条件分别进样，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度（mg／mL） 为横坐标（X） 绘制标准曲线，并进行回归，得水杨苷的回归方程分别为：Y＝2．12e+006X-9．91e+003，（r＝0．9999），结果表明水杨苷在0．04208 mg／mL～0．4208 mg／mL 范围内，线性关系良好。

2．5 精密度试验 分别精密吸取同一份对照品溶液10 μL，重复进样6 次，测定水杨苷峰面积，其RSD为0．4%，表明仪器精密度良好。

2．6 重复性实验 取杨树花药材粉末5 份，每份0．5 g，精密称定，按照“2．3”项下方法制备供试品溶液，照“2．1”项下色谱条件，测定水杨苷含量，RSD值为1．0%，表明该方法重复性良好。

2．7 稳定性试验 杨树花药材粉末0．5 g，精密称定，按“2．3”项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，10，12 h 照“2．1”项下方法，测定峰面积，RSD值为0．7%，表明供试品溶液在12 h 内基本稳定。

2．8 回收率试验 取供试品0．25 g（平均含量为5．3 mg／g），精密秤定，分别按含水杨苷80%、100%、120% 加入水杨苷对照品储备液，照“2．1”下方法测定水杨苷含量，计算平均回收率及RSD值，结果见表2。

2．9 耐用性 试验考察安捷伦ZORBAX SB-C18（3．0×250 mm，5-Micron）、博纳艾杰尔Venusil XBP C18（2）（4．6×150 mm，5 μm）、Waters Xbrige TM C18，（4．6×150 mm，5 μm） 三种不同品牌的色谱柱，照“2．1”项下方法测定不同品种杨树花中水杨苷的含量，均能满足要求，结果见表3。

表2 水杨苷回收率试验（n=9）Tab 2 Recovery test of Salicin（n=9）

表3 耐用性试验Tab 3 durability test

2．10 含量测定 分别取不同产地，不同品种杨树花样品，各3 批，按“2．3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，按上述方法测定样品中水杨苷的含量，结果见表4；水杨苷含量的分布图见图1。

3 讨 论

3．1 供试品溶液制备方法考察

3．1．1 不同提取溶剂的考察 试验考察了水、乙醇、甲醇、50%乙醇、50%甲醇5 种不同提取溶剂，比较不同溶剂提取水杨苷含量的差异。

取杨树花粉末0．5 g，精密称定，分别加水、乙醇、甲醇、50%乙醇、50%甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放至室温，用相应溶剂补足重量，滤过，取续滤液作为供试品溶液，照“2．1”项下方法测定其峰面积、分离度、峰面积、峰高理论塔板数、峰纯度等相关参数，结果见表5，图2。

表4 不同产地及品种杨树花水杨苷含量Tab 4 content of Salicin in poplar from different producing areas and varieties

图1 水杨苷含量分布Fig 1 Distribution of populin content

通过不同溶剂提取结果的比较，水、甲醇、乙醇、50%乙醇、水杨苷峰纯度不够，且前3 种溶剂提取的样品，分离度均小于1．5，达不到要求。而50%甲醇作为提取溶剂，峰纯度较好，分离度好，无杂质干扰。因此选择50%甲醇作为提取溶剂。

表5 不同提取溶剂考察结果Tab 5 Investigation results of different extraction solvents

3．1．2 提取方法的考察

3．1．2．1 超声提取法 取杨树花药材粉末0．5 g，精密称定，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声30 min，取出放至室温，用50%甲醇补足重量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。照“2．1”项下方法测定水杨苷的含量，结果见表6、图3。

3．1．2．2 回流提取法 取杨树花药材粉末0．5 g，精密称定，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，回流30 min，取出放至室温，用50%甲醇补足重量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。照“2．1”项下方法测定水杨苷的含量。结果见表6、图4。

图2 50%甲醇提取水杨苷HPLC 色谱图Fig 2 50%methanol extraction Salicin HPLC chromatogram

图3 超声提取法水杨苷HPLC 色谱图Fig 3 determination chromatogram of Salicin content extracted by ultrasound

图4 回流提取法水杨苷HPLC 色谱图Fig 4 chromatographic diagram for the determination of Salicin content extracted by reflux extraction

表6 不同提取方法水杨苷色谱峰参数比较

由上表可知，两种提取方法，峰纯度都比较好，但超声提取法的峰面积和理论塔板数较回流提取法低。因此，选择回流提取法作为样品的提取方法。

3．1．3 不同取样量的考察 分别取杨树花药材粉末0．5、1、2、5 g，精密称定，分别精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，分别回流30 min，取出放至室温，用50%甲醇补足重量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。照“2．1”项下方法测定水杨苷的光谱纯度。结果表7。

表7 不同取样量水杨苷光谱纯度Tab 7 Purity of Salicin peak in different sampling quantities

由上表可知，取样量为0．5 g 时，水杨苷光谱纯度最佳。其他取样量水杨苷色谱峰纯度角大于纯度阈值，纯度均不纯，因此，选择取样量为0．5 g。

3．1．4 不同提取时间的考察 取杨树花药材粉末0．5 g，精密称定，分别精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，分别回流30、60、120 min，取出放至室温，用50%甲醇补足重量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。照“2．1”项下方法测定水杨苷，结果见表8。

表8 不同提取时间水杨苷峰参数Tab 8 Effects of different extraction time on Salicin Peak parameters

由上表可知，提取时间为30 min 时，杨树花中水杨苷含量最高，且峰分离度好。因此，选择提取时间为30 min。

综上，最终确定文中所述供试品的制备方法。

试验比较了甲醇-水，乙腈-水，甲醇-乙腈-水系统对水杨苷洗脱的效果，发现乙腈-水系统对水杨苷洗脱能力最强，出峰时间快，但在样品中，分离度不好，不容易与杂质峰分开；甲醇-水系统理论塔板数太低，出峰时间晚；相比甲醇-乙腈-水系统理论塔板数较高，分离度较好。

通过不同品种杨树花中水杨苷的测定比较发现，毛白杨中的水杨苷含量最高，其次沙兰杨、银白杨、中华红叶杨，加杨、黑杨和川杨中水杨苷含量最低。原因可能与不同品种杨树雄花序盛开掉落后形态结构有关，毛白杨雄花序花苞片和雄蕊丰满完整，中华红叶杨雄花序掉落后只剩下雄蕊和花干，而加杨、黑杨掉落后只剩下花干。这也间接证明杨树花的化学成分主要集中在苞片上，因此毛白杨中水杨苷含量最高。

对于同一品种毛白杨来说，不同地域也有较大差异性，山东、陕西＞河南、山西＞河北＞北京。

对于同一产地同一品种山西来说，山西太原、市政府、农业大学三者含量基本相当，均高于森林公园的杨树花中水杨苷含量。