未知茵的实验室基础研究

王薪 龚维瑶 陈宜涛 林美爱

摘要：在活化培养放线菌A45时，发现原平板上放线菌有被抑制现象，通过进一步分离培养及接种，确定其确有抑制放线菌A45的能力。为了研究该菌的抑菌效果，通过有机试剂乙酸乙酯萃取该菌发酵液，制备滤纸片，发现该菌发酵液对甲型副伤寒杆菌和表皮葡萄球菌抑菌能力较好。通过微量肉汤稀释法测定其最低抑菌浓度，可得该菌产生的抑菌成分对表皮葡萄球菌、伤寒杆菌、甲型副伤寒杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为8mg/mL，对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌浓度为16mg/mL。最后通过薄层层析最佳流动相的测定探索出两个较好的系统，分别为甲醇：正丁醇：冰乙酸：蒸馏水=9：7：1：2（体积），正丁醇：乙醇：蒸馏水=3：7：7（体积）。

关键词：未知菌;抑菌活性;最低抑菌浓度;分离系统

中图分类号：Q93-331 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2019）12-0056-03

本研究基于学生实验发现的现象进行进一步主动探索。由于该菌可生长在放线菌A45平板中，暂认为该菌与放线菌A45需相同的生活环境。对于在实验中发现的新菌种，如能及时采取对其的纯化培养和确认，可能会对以后的实验及研发带来有利影响。但该实验现停留在实验室基础研究层面，还需进一步进行PCR测序实验，确定该菌真实身份。

1实验材料

1.1试剂

三氯甲烷（浙江迪耳药业有限公司）、乙酸乙酯（华东医药股份有限公司）、石油醚、正丁醇（成都市科龙化工试剂厂）、牛肉膏（北京双旋微生物培养基制品）、蛋白胨（天津市光复精细化工研究所）、氯化钠（上海试四赫维化工有限公司）、琼脂（天津市科密欧化学试剂有限公司）、可溶性淀粉（南京化学试剂有限公司）、硝酸钾（无锡市东晶化学试剂有限公司）、磷酸氢二钾（西陇化工股份有限公司）、七水硫酸镁（无锡市佳妮化工有限公司）、七水硫酸亚铁（巨化集团公司试剂厂）。

1.2仪器

精密电子天平（型号：PB203-N，梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司）;4℃冰箱（BCD-205E/Y，海尔集团）;苏泊尔微电磁炉（型号：C19A01-A，浙江苏泊尔股份有限公司）;智能生化培养箱（宁波海曙赛福实验仪器）;振荡培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）;立式压力蒸汽灭菌器（型号：YXQ-LS，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9240A，上海精宏实验设备有限公司）;无菌操作台（型号：JB-VS-840U，苏州佳宝净化工程设备有限公司）;精密试纸（pH 6.4-8.0，上海三爱思试剂有限公司）;可调微量锁紧移液器（型号：WKYⅣ-5，上海佳音分析仪器厂）;烧杯（50mL、100mL、500mL、1000mL和2000mL）;量筒（50mL、100mL、250mL和1000mL）;锥形瓶（100mL、250mL和500mL）;分液漏斗（250mL）;10mL移液管;纱布;微量移液器和枪头（20lxL，200uL和1000uL）;接种环;酒精灯;脱脂酒精棉;培养皿;玻璃棒。

1.3培养基

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCI5g/L，琼脂18g/L，pH 7.4-7.6。

高氏一号培养基：可溶性淀粉20g/L，KN03 1g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4-7H2O 0.5g/L，NaCI 0.5g/L，FeSO4-7H2O 0.mg/L，琼脂18g/L，pH 7.4-7.6。

液体培养基均是上述配方不加琼脂。

1.4菌种

放线菌A45，枯草芽孢杆菌，甲型副伤寒杆菌，大肠杆菌，表皮葡萄球菌，伤寒杆菌，痢疾杆菌，金黄色葡萄球菌（均由本实验室保存）。

2实验方法

2.1未知菌株的发现

无菌条件下，培养本实验室保存的放线菌A45，从中挑取未知菌种进行分离纯化培养，挑取纯化的单个菌落，点在密集划线的正常放线菌A45平板上，放培养箱28℃倒置培养48h观察。

2.2未知菌株的发酵培养

无菌条件下，挑取未知菌株单个菌落接种于高氏一号培养液，置于振荡培养箱内以200r/min 28℃振荡培养4d。待大部分孢子成熟后，即可用于发酵培养。按照8%（20mL）的接菌量接种于新的高氏一号培养液中，置于振荡培养箱内以200r/min 28℃振荡培养4d。

2.3抑菌活性物质的萃取浓缩

将澄清的发酵液用有机溶剂进行萃取。加入1/4体积的有机溶剂，充分搅拌后静置4h，收集有机相和水相，用滤纸片法检测各相萃取液的抑菌活性，将有活性相萃取三次后分别合并。将合并相于70℃下旋转蒸发浓缩，4℃保存备用。

2.4活性物质的抑菌实验

2.4.1滤纸片法

无菌条件下，用无菌镊子夹取直径为5mm的圆形无菌滤纸片分别放入需检测的溶液中，充分浸泡，2h后取出无菌风干，备用。将活化好的供试菌株密集划线接种于无菌平板上，用镊子夹取风干的滤纸片放在接种的平板上。放入培养箱。37℃倒置培養24h，观察结果。

2.4.2微量肉汤稀释法

无菌操作，将制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经肉汤1：1000稀释后分别加到无菌96孔聚苯乙烯板中的第1-11孔，每孔中加180ul。将不同浓度梯度的粗提物溶液分别加到上述1-10孔中，每孔20ul，第11孔不加粗提物作为生长对照。使第1-11孔最终粗提物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0mg/ml，将96孔板密封后置35～C普通空气孵育箱中，孵育24h，用酶标仪在630nm处检查吸光度值，记录实验数据。

2.5抑菌成分分离

展层剂于展层缸中饱和。毛细管将样品点样到薄层层析硅胶板上，点样斑点直径不超过2mm，单次点样，样点距薄层一端约1cm。将硅胶板放入已饱和的层析缸中展开，当展层溶剂上行到距硅胶板另一端边缘1cm处时取出，放置于空气中自然干燥，紫外灯下观察其条带情况。通过选取不同展层剂对样品进行分离，确定样品的最适展开条件。