柑橘皮生产单细胞蛋白饲料的固态发酵工艺研究

李佳瑶，周 珺，王 媛，温宇婵，赵宝顶，张 怡

(天津农学院农学与资源环境生物技术系 天津300384)

0 引 言

柑橘是世界第三大贸易农产品。目前，全国每年产生的柑橘皮渣在千万吨以上[1]，对柑橘皮渣的处理已成为各食品加工企业的重大难题。柑橘皮渣含有丰富的碳水化合物、脂肪、维生素、氨基酸和矿物质等营养成分，可以作为微生物发酵的基质。同时，柑橘皮渣中含有大量的纤维素、木质素和果胶类等生物大分子物质[2]，经过处理可将其降解为微生物可利用的小分子物质，生产附加值高的单细胞蛋白新饲料。固体发酵作为一种发酵方法，过程容易控制、能耗低、操作简单、发酵产物高、对无菌环境要求相对低、不易发生大面积污染。本实验以柑橘皮为原料，通过测定已降解粗纤维和生成蛋白质含量，优化发酵培养基配方，在保证蛋白质含量较高的前提下，选取粗纤维降解率较大的生产工艺。

1 材料和方法

1.1 实验器材和试剂

1.1.1 实验器材

粉碎机、电炉、凯氏定氮仪、冷凝管、真空泵、烘箱、电阻炉、干燥器。

1.1.2 试剂

0.882 mol/L氢氧化钠、3.5mL硫酸、无水乙醇、40%氢氧化钠溶液、2%硼酸、25%氢氧化钠溶液、10%硫酸铜溶液、0.1%甲基红、0.1%溴甲酚绿、大约0.1mol/L盐酸、尿素、硫酸铵、2g/100mL磷酸二氢钾、0.25g/100mL硫酸镁。

1.1.3 菌种

混合菌种(绿色木霉、康宁木霉、枯草芽孢杆菌)通过淘宝网购自苏柯汉生物酶制剂。

1.2 制备柑橘皮渣

将柑橘剥取外皮，洗净、烘干、粉碎成末，即得到柑橘皮渣。

1.3 正交培养基配方设计

以柑橘皮渣 9g和麸皮 1g为发酵底物，加入混合菌种0.1g，利用4水平 5因素正交试验，对尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁和水的添加量进行优化，培养温度为 30℃，培养时间为 72h。通过测定蛋白质和已降解粗纤维，筛选最佳培养基配方，确定最佳工艺。

表1 正交试验设计Tab.1 Orthogonal experiment design

1.4 采用凯氏定氮法测定蛋白质含量

称取 10g固体发酵后样品置于烧杯中加水，水沸腾后计时，30min后立即依次加入适量的氢氧化钠和硫酸铜溶液，沉淀静置 2h以上或过夜；溶液中沉淀用滤纸抽滤，温水洗涤 5～6次直至检验无硫酸根离子为止，沉淀连同滤纸放入 75℃干燥箱中干燥60min。将消化管润洗后放入 25℃干燥箱中烘干；将沉淀物放入消化管中，加入催化剂和 15mL硫酸在通风橱中消化 1～1.5h，消化管中颜色变至浅黄色后加 5～6滴水，再消化 0.5h，当颜色为浅蓝色或接近无色时取出冷却。测定空白体积，再滴定样品，向消化管中加入盐酸、水、氢氧化钠、硼酸和指示剂，以溶液颜色由蓝绿色变为灰红色为终点。将仪器按说明书清洗，测试仪器稳定性 2～3次，所得滴定数据极差不超过0.05，所得滴定体积即为测定蛋白质空白体积[3-4]。此外测定空白体积一次。

1.5 采用酸碱法测量纤维素含量

将 1.734g固体发酵后样品和 200mL煮沸的硫酸进行回流，加热使之微沸并经过 30min后样品质量记作 W(g)。在圆底烧瓶中加入 200mL煮沸的氢氧化钾溶液，加热沸腾后回流 30min，取滤纸在105℃下烘10min称重记作W0(g)。将圆底烧瓶中所有溶液抽滤，再用热蒸馏水充分洗涤至中性后加入60℃无水乙醇 25mL，然后洗涤、再抽滤。将滤纸及滤纸上的残留物放入坩埚中，将坩埚和内容物置于130℃的烘箱中烘 120min至恒重，立即闭盖并放入干燥器中 30min，即得残留物，称重记作 W1(g)。将坩埚放在电炉上加入直至无烟拿出。将炭化的坩埚放入电阻炉中，电阻炉温度大约为550℃时开始计时30min，灼烧至恒重，取出将其放入干燥器中30min，称重记作W2(g)[5-6]。

计算：已降解的纤维素百分含量=100%-(W1-W2-W0)/W×100%

式中：W 为样品初始质量；W0为烘干后滤纸的质量；W1为坩埚和内容物烘干后的质量；W2为坩埚和内容物灰化后的质量。

1.6 最佳配方重复

柑橘皮中已降解粗纤维和蛋白质含量测定后，使用DPS软件对数据进行处理，通过正交试验，得出最佳结果，选出最佳培养基。

2 结果与分析

2.1 柑橘皮固态发酵正交试验产蛋白含量

采用正交试验方法，进行不同配方的发酵培养基试验，测定蛋白质含量，结果如表2。

表2 蛋白质含量Tab.2 Protein content

续表2

从 R值可知，影响正交实验结果的因素依次为A＞B＞D＞E＞C，即影响降解纤维素的因素依次为尿素＞硫酸铵＞硫酸镁＞水＞KH2PO4。从 K值可知，在 A4B4C3D4E3的配方下，蛋白质有较高产量。从相关系数可知，尿素、硫酸铵、硫酸镁、水呈现正相关，磷酸二氢钾呈现负相关。

2.2 柑橘皮固态发酵正交试验已降解粗纤维

从 R值可知，影响正交实验结果的因素依次为C'＞E'＞A'＞D'＞B'，即影响降解纤维素的因素依次为KH2PO4＞水＞尿素＞硫酸镁＞硫酸铵。从K值可知，在 A'1B'2C'4D'1E'1的配方下，纤维素的降解程度最大。从相关系数可知，硫酸铵和磷酸二氢钾呈现正相关，尿素、硫酸镁和水呈负相关(表3)。

2.3 重复试验结果与分析

结合以上两组相关性数据进行分析，发现两组数据中硫酸铵均为正相关。因为本实验以生成的蛋白质含量为最终目标，所以观测指标是以生成的蛋白质含量为主。在表1中，尿素、硫酸镁、水呈现正相关；表2中，硫酸二氢钾呈现正相关。综合上述相关性结论分析，最佳配方为0.15g尿素、0.3g硫酸铵、0.06g磷酸二氢钾、0.0075g硫酸镁和14mL水。

取上述最佳配方进行重复试验：以柑橘皮渣 9g和麸皮 1g为发酵底物，加入混合菌种 0.1g，在含0.15g尿素、0.3g硫酸铵、0.06g硫酸二氢钾、0.0075g硫酸镁和 14mL水的培养基 30℃培养72h。培养完成后，测定蛋白质含量和已降解纤维素，结果如表4。

由表4可知，此次重复实验结果中生成蛋白质含量和已降解的纤维素虽没有高于正交试验中最大值，但也处于相对较高的水平。结合上述相关性分析，重复试验结果与相关性分析结论相符，所以优化后配方在保证蛋白质产量的基础上更大程度地降解了纤维素，初步判断此配方适用。

表3 已降解的粗纤维Tab.3 Degraded crude fiber

表4 最佳配方重复实验Tab.4 Results of repeated experiments

3 讨论与结论

①在接种的时候一定要将菌种均匀地接入到固体培养基中。在固体培养基中菌体活动能力没有在液体培养基中强，接种不均匀可能导致菌体生长不一，获得营养成分不等之类问题，会给试验结果带来影响。而且，固体发酵底料要妥善保存，避免染菌变质导致其中营养被消耗。

②综合试验结果可知，混合菌种(绿色木霉、康宁木霉、枯草芽孢杆菌)在 30℃的条件下，以柑橘皮为主要原料，0.15g尿素、0.3g硫酸铵、0.06g硫酸二氢钾、0.0075g硫酸镁和 14mL水的培养基中培养72h，可在保证蛋白质高产量的基础上更大程度地降解纤维素。