玉米酒精糟毒素的微生物降解研究

2019-07-15王德慧聂志岩王少海童应凯商志聪申丹凝魏雅婷张乃楠

天津科技 2019年6期

王德慧，聂志岩，王少海，张怡，童应凯，商志聪，申丹凝，田晴，魏雅婷，张乃楠

(天津农学院农学与资源环境学院生物技术系天津300384)

0 引言

近些年来，由于汽油加入部分酒精等原因，我国工业用燃料乙醇生产量大幅增加，玉米酒精糟是由玉米发酵生产酒精之后留下的副产物，大量实验结果表明，玉米酒精糟所含蛋白质高达 26%。喂羊能加速羊的增重，提高羊毛的产量；饲养牛还可以促进生长，提高饲料报酬；饲养奶牛可提高产奶量，提升乳脂率。因此，我国已经逐渐开始使用玉米酒精糟作为饲养家畜的饲料。它通常被用来替换豆粕畜禽混合饲料，比例高达 30%，并且可以直接用于饲喂给动物，消耗大。然而，玉米中的霉菌毒素几乎所有都在玉米酒糟内积累，所以其中霉菌毒素含量很高。常规的解毒方法包括碱处理法、氧化处理方法、高温方法、吸附剂方法，以及一种抗氧化剂的方法。然而，这些方法有一系列缺点，如破坏营养、不完全解毒、成本高，解毒的效果在实际使用中并不理想。因此，生物脱毒技术逐步成为研究的焦点，该技术主要利用微生物的代谢产物，例如酶类，分解破坏产生低毒或无毒的降解产物。微生物及生物酶脱毒因为具有解毒效率高、特异性强、对饲料以及环境无污染等优点而备受研究者重视。目前，各种微生物，包括细菌、放线菌和酵母，已被发现具有降解毒素的能力。由于生物方法是在温和的条件下进行处理，从而使毒素的毒性减小，具有对原料的感官性状、适口性、营养物质影响较小，而且解毒效率高、特异性较强、对饲料和环境没有污染的特点和优势，近年来备受关注[1]。

黄曲霉毒素(AFT)是主要由黄曲霉寄生曲霉产生的次生代谢产物，在湿热地区的食品和饲料中出现黄曲霉毒素的可能性非常高。黄曲霉毒素在土壤、动物、植物中广泛存在，是一类致癌物质，对人体健康极为有害。

伏马菌素(FM)是串珠镰刀菌在一定温度和湿度条件下产生的一类霉菌毒素，多见于粮食和饲料中。需要特别指出的是，玉米作为主要的粮食，最容易感染伏马菌素[2]。伏马毒素可引起多种动物疾病，如马白质软化病、猪肺水肿综合征、实验性大鼠肾癌和肝癌等，并且被认为与人类食管癌和神经管缺陷的发生率有很大关系。

呕吐毒素(DON)源于镰刀菌属，属于单端孢霉烯族化合物，是最常见的玉米类型污染物。当人类和动物摄取含呕吐毒素的食物后，可引起一系列的急性中毒症状，如食欲不振、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳和反应迟钝，严重损害造血系统。不同动物对呕吐毒素的敏感程度大不相同，猪是对呕吐毒素最为敏感的动物，断奶仔猪对其非常敏感[3]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

酵母19-1：天津农学院微生物实验室保藏菌种。

斜面培养基：YEPD1%，酵母膏 2%，蛋白胨2%，葡萄糖，加入 2%琼脂粉。pH 值=6.0(灭菌条件：121℃，20min)。

种子培养基：YEPD 1%，酵母膏 2%，蛋白胨2%，葡萄糖。pH值=6.0(灭菌条件：121℃，20min)。

发酵培养基：酒糟、麸皮、水、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸铵、葡萄糖(灭菌条件：105℃，40min)。

1.2 仪器与设备

恒温振荡培养箱、微孔板酶标仪、高压蒸汽灭菌锅、鼓风干燥箱、电子分析天平、超净工作台、漩涡振荡仪、恒温培养箱。

毒素测定试剂盒：呕吐毒素(DON)试剂盒、伏马菌素(FM)试剂盒、黄曲霉毒素(AFT)试剂盒均为山东绿都生物科技有限公司出品。

1.3 测定方法

从石蜡油封存的保存菌种中挑取一环菌种接入斜面培养基，30℃培养 20h，再对其重复上述操作2次，然后接入种子培养基中，(取40mL培养基放入250mL广口三角瓶)放入摇床，培养条件：30℃，200rpm/min，20h。

接种量为 5%，分别接入配方不同的发酵培养基中(配方如表1)，充分混匀后，放入恒温培养箱中30℃培养 72h。发酵结束后，放入烘箱，75℃烘干10h以上直至质量不再减少，研磨，放入自封袋中，保存备用。

1.4 正交试验方法

以9g酒精糟和1g麸皮为底物，对硫酸铵、水、硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖5种添加剂进行L16(54)的正交试验，确定其最佳固态发酵配方，正交表设计如表1和表2所示。

由于部分成分加入量相对较少，将各因素配制成溶液，不仅极大减小了误差，而且方便添加。

表2 正交试验实施表Tab.2 Implementation table of orthogonal test

取10g硫酸铵加无菌水定容至100mL；取0.1g硫酸镁加无菌水定容至100mL；取1.0g磷酸二氢钾加无菌水定容至100mL。

将表2各处理号试剂分别加入刻度试管，置于以9g酒精糟和 1g麸皮为底物的固体培养基中，充分搅拌，高压灭菌后，进行接种，搅拌均匀。接种完成后，将样品放入30℃恒温培养箱培养72h，测定呕吐毒素，伏马毒素和黄曲霉毒素的具体含量。对正交试验结果进行分析，选出最佳培养基配方。

1.5 测定方法

酶联免疫标记法(ELISA)：将所需试剂从冷藏环境中取出，待其完全升至室温(20～25℃)后方可使用。按照试剂盒说明书进行具体操作，最后用酶标仪立即测定450nm处的吸光值。

2 结果与分析

2.1 试验结果

通过正交试验，测定发酵后 3种毒素的剩余量，用极差分析方法选出最佳培养基配方，结果如表3所示。通过对正交试验结果进行分析，得到以下结果：

①降解黄曲霉毒素总量的最优组合为A1B3C1D3E1，即硫酸铵0%，水14mL，硫酸镁0%，磷酸二氢钾0.1%，葡萄糖0%，可降解61%的黄曲霉毒素。

②降解伏马毒素的最优组合为 A1B2C4D2E1，即硫酸铵 0%，水 12mL，硫酸镁 0.015%，磷酸二氢钾0.05%，葡萄糖0%，可降解77.8%的伏马毒素。

③降解呕吐毒素的最优组合为 A1B4C2D1E3，即硫酸铵 0%，水 16mL，硫酸镁 0.05%，磷酸二氢钾0%，葡萄糖2%，可降解88%的呕吐毒素。

④由于黄曲霉毒素总量在原酒糟中就没有超标，因此在寻找最优搭配时可忽略此毒素。

⑤为从呕吐毒素和伏马菌素中选出一个最优组合，将DON的组合带入FM中去，发现效果不好，而将FM的组合带入DON中去，发现效果较好。

2.2 最佳配方重复试验结果验证

最佳配方重复实验做2组：依照上述的固体培养基制备方法，称取 9g酒精糟和 1g麸皮，以此为底物，加入硫酸铵0%，水 12mL，硫酸镁0.015%，磷酸二氢钾 0.05%，葡萄糖 0%，灭菌后接入 5%酵母菌液，30℃培养72h。

按照上述测定方法，对 3种毒素进行测定，发现测定结果高于正交试验降解率，因此，此配方为最佳配方。

表3 正交试验结果分析Tab.3 Analysis results of orthogonal test

3 讨论与结论

3.1 避免操作不当产生误差

操作时室温严格控制在规定范围内，温度和时间应按说明书规定力求准确，因此每人操作时一次不宜多于两块板；每一种液体试剂使用前必须摇匀，加样时应将所加物加在板孔底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。

3.2 试验因素的选择

硫酸铵在培养中，能为酵母菌提供适量氮源；磷酸二氢钾主要起的是缓冲 pH值的作用，同时在培养基中增加磷和钾的成分；硫酸镁中镁元素是许多酶的活化剂，能促进碳水化合物的新陈代谢、核酸的合成、磷酸盐的转化等；葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，是一种多羟基醛，在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。