“从小便去之”对气道黏液高分泌模型大鼠肾素-血管紧张素-醛固酮系统和细胞因子的影响研究

许宗颖，石少华，于瀚，钟相根

本研究价值：

“从小便去之”为仲景治疗痰饮的重要法则之一，肾气丸为仲景温肾利水治疗痰饮的代表方剂，本研究以肾气丸（温肾利水）、苓桂汤（化气利水）、肾气丸去苓桂（温养肾气）干预气道黏液高分泌模型大鼠，探讨三者对大鼠的干预作用，以肾素-血管紧张素-醛固酮（RASS）系统及细胞因子为切入点，探讨温肾/利小便治疗气道黏液高分泌的生物学机制，以期为临床诊疗该疾病提供一种新的思路，为丰富和发展中医药治疗肺系疾病做出有益的科学探索。

“凡食少饮多，水停心下，甚者则悸，微者短气。”［1］微饮即水饮之微者。水入不化，上逆于肺，阻碍气机，或见“短气”。“短气”即呼吸短促，类似于微喘、气难以续接。“夫短气有微饮，当从小便去之，苓桂术甘汤主之，肾气丸亦主之”，仲景提出微饮的治疗原则为“当从小便去之”，治以苓桂术甘汤或者肾气丸，使微饮随膀胱气化而出［1］。

气道黏液高分泌主要是由黏蛋白基因过度表达和黏液分泌细胞增多导致［2］，可出现咳嗽、咳痰、喘息、胸闷等气道阻塞症状［3］，其临床表现类似于“短气，有微饮”。肾气丸为仲景以利小便法治疗痰饮的代表方剂，已被证实可应用于痰饮咳喘、慢性阻塞性肺疾病、哮喘的治疗［4-6］，但其干预作用与“从小便去之”的相关性尚未被报道。本研究以肾气丸为例，结合经典药对苓桂，对肾气丸、苓桂及其联合用药进行研究，从肾素-血管紧张素-醛固酮（RASS）系统和细胞因子的角度诠释“夫短气，有微饮，当从小便去之，苓桂术甘汤主之，肾气丸亦主之”的部分生物学内涵，为丰富和发展中医药治疗肺系疾病做出有益的科学探索。

1 材料与方法

1.1 实验时间 本实验时间为2017年4—8月。

1.2 实验材料

1.2.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（180±20）g，合格证号：SCXK（京）2016-0002，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供。饲于室温（25±0.5）℃，相对湿度（55±5）%；采用12 h/12 h明暗光照，自由摄食饮水。

1.2.2 实验药物 肾气丸药液：生地24 g，山药12 g，茯苓12 g，桂枝9 g，泽泻9 g，制附子3 g，吴茱萸12 g，丹皮12 g。苓桂汤：茯苓12 g，桂枝9 g。肾气丸去苓桂汤：生地24 g，山药12 g，泽泻9 g，制附子3 g，吴茱萸12 g，丹皮12 g。上述药物购于中国北京同仁堂（集团）有限责任公司。各方加水适量，煎煮前先浸泡40 min，每次煎煮20 min，共煎煮2次。混合2次药液，置于65 ℃恒温水浴浓缩至100 ml/剂，灭菌后于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 主要试剂与仪器 丙烯醛（成都化夏化学试剂有限公司生产，CAS：107-02-8，北京百诺威生物科技有限公司提供），戊巴比妥钠（美国Sigma公司），大鼠白介素（IL）-1β ELISA试剂盒（美国Abcam公司），IL-13 ELISA试剂盒（美国Rockland公司），转化生长因子（TGF）-α ELISA试剂盒（美国LifeSpan Biosciences公司），肿瘤坏死因子（TNF）-α ELISA试剂盒（美国Enzo Life Sciences公司），自制动物雾化箱（200 cm×100 cm×50 cm），雾化器（402B，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司），小动物肺功能测定仪（北京贝兰博科技有限公司），全波长酶标仪（Multiskan MK3，美国Thermo公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与模型制备 大鼠适应性喂养7 d后，采用随机数字表法分为正常组、模型组、肾气丸组（温肾利水）、苓桂组（化气利水）、肾气丸去苓桂组（温养肾气），每组12只。模型组、肾气丸组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠雾化吸入3 mg/L丙烯醛，3 h/次，2次/d，持续4周，进行造模，结束后各组任取2只做病理切片，光镜观察，出现纤毛粘连，杯状细胞增生，肺泡间隔变薄或断裂，可确定气道黏液高分泌模型造模成功。正常组雾化吸入等量0.9%氯化钠溶液。

1.3.2 干预措施 干预第5周开始，肾气丸组给予肾气丸药液灌胃，苓桂组给予苓桂汤灌胃，肾气丸去苓桂组给予肾气丸去苓桂汤灌胃，均1 ml/100 g、2次/d、持续4周；正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃。给药剂量参考人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表［7］。造模期间，模型组、肾气丸去苓桂组各死亡2只大鼠，肾气丸组、苓桂组各死亡1只大鼠。肾气丸组和苓桂组由于相互攻击分别死亡1只大鼠。实验结束时5组各剩余8只大鼠。由于实验条件有限，正常组随机抽取8只大鼠进行后续实验。

1.3.3 标本采集与指标检测 取材前24 h，各组大鼠禁食，自由饮水，置于代谢笼中收集尿液，并统计24 h尿量。以0.3%戊巴比妥钠（1 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，自大鼠颈部切开，暴露气管，在气管软骨间环剪开一小切口，从切口插入气管插管，在切口下方用缝合线将气管和气管插管结扎紧，仰卧头低位置于小动物肺功能测定仪的密闭体积描计箱内，气管插管一端与动物呼吸机相连。当大鼠呼吸时，肺的扩张和收缩改变了箱内的压力，通过测量箱内气体压力的变化间接获取肺容量的变化。自动记录肺功能参数，包括第0.3秒用力呼气末容积（FEV0.3）、用力肺活量（FVC）、第0.3秒用力呼气末容积占用力肺活量百分比（FEV0.3/FVC%）、最大呼气流量（PEF）。然后取出气管插管，结扎右侧肺门，采用聚乙烯导管行左主支气管插管，导管插至左主支气管分叉处，双线结扎固定导管，用注射器缓慢灌入2.5 ml 4 ℃无菌0.9%氯化钠溶液，同时稍微用力按摩胸部，以便灌洗充分，间隔1 min将肺泡灌洗液（BALF）回收，反复3次，回收约2.5 ml。将上述收集的BALF于低温（4 ℃）下1 500 r/min离心10 min（离心半径9.5 cm），吸取上清液2 ml，于-80 ℃冻存，分装备用待ELISA法检测。腹主动脉取全血，3 000 r/min离心15 min（离心半径9.5 cm），抽取上层血清于-80 ℃冻存备用。

采用ELISA法检测BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α和血清中外周血肾素活性（PRA）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）。按试剂盒说明书进行操作，选取6个合格样品进行检测。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件处理数据。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐则采用LSD-t检验，若方差不齐则采用非参数检验的Tamhane's T2法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠24 h尿量比较 各组大鼠24 h尿量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、肾气丸组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠24 h尿量高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；肾气丸组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠24 h尿量高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；苓桂组大鼠24 h尿量高于肾气丸组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 各组大鼠肺功能参数比较 各组大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC%、PEF比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC%、PEF低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；苓桂组大鼠FEV0.3/FVC%低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；肾气丸组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠FEV0.3、FVC、PEF高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；肾气丸组、肾气丸去苓桂组大鼠FEV0.3/FVC%高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.3 各组大鼠BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α比较 各组大鼠BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；肾气丸组大鼠BALF中TNF-α高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；肾气丸组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠BALF中IL-1β、TNF-α高于肾气丸组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.4 各组大鼠血清中PRA、AngⅡ、ALD比较 各组大鼠血清中PRA比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；各组大鼠血清中AngⅡ、ALD比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组大鼠血清中AngⅡ、ALD高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠血清中ALD高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；肾气丸组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠血清中AngⅡ、ALD低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；肾气丸去苓桂组大鼠血清中ALD高于肾气丸组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4）。

表1 各组大鼠24 h尿量比较（n=8，±s，ml）Table 1 24-hour urine volume in different groups

表1 各组大鼠24 h尿量比较（n=8，±s，ml）Table 1 24-hour urine volume in different groups

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与肾气丸组比较，cP＜0.05

组别 24 h尿量正常组 8.63±2.06模型组 19.88±6.03a肾气丸组 27.69±5.31ab苓桂组 35.13±8.90abc肾气丸去苓桂组 28.80±9.01ab F值 18.068 P值 ＜0.001

表2 各组大鼠肺功能参数比较（n=8，±s）Table 2 Levels of pulmonary function parameters in different groups

表2 各组大鼠肺功能参数比较（n=8，±s）Table 2 Levels of pulmonary function parameters in different groups

注：FEV0.3=第0.3秒用力呼气末容积，FVC=用力肺活量，FEV0.3/FVC%=第0.3秒用力呼气末容积占用力肺活量百分比，PEF=最大呼气流量；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

PEF（ml/s）正常组 5.61±0.30 6.21±0.39 94.49±2.08 26.29±1.71模型组 3.73±1.30a 4.97±0.56a 83.72±5.20a 18.67±4.70a肾气丸组 5.46±0.60b 6.13±0.84b 89.504±4.27b 25.75±1.68b苓桂组 5.37±0.70b 6.14±0.56b 88.73±6.41a 25.68±3.64b肾气丸去苓桂组 5.43±0.77b 5.95±0.94b 89.24±7.39b 22.81±4.34b F值 7.623 4.863 4.046 8.831 P 值 ＜0.001 0.003 0.008 ＜0.001组别 FEV0.3（ml）FVC（ml）FEV0.3/FVC%（%）

表3 各组大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α比较（n=6，±s，pg/ml）Table 3 Levels of IL-1β，IL-13，TGF-α，and TNF-α in the BALF in different groups

表3 各组大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α比较（n=6，±s，pg/ml）Table 3 Levels of IL-1β，IL-13，TGF-α，and TNF-α in the BALF in different groups

注：IL=白介素，TGF=转化生长因子，TNF=肿瘤坏死因子；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与肾气丸组比较，cP＜0.05

组别 IL-1β IL-13 TGF-α TNF-α正常组 498.18±133.56 8.53±3.05 37.20±9.66 14.47±1.91模型组 14 798.44±3 643.03a107.27±14.55a 84.25±8.05a 37.65±8.22a肾气丸组 2 473.66±1 550.59b 15.05±3.99b 43.55±10.30b 22.78±3.77ab苓桂组 6 460.98±1 160.85abc 20.13±5.24ab 57.30±8.25abc 26.16±3.49ab肾气丸去苓桂组 7 062.66±2 521.23abc20.48±5.10ab 58.30±10.36abc26.61±5.06ab F值 38.825 174.349 22.404 16.956 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表4 各组大鼠血清中PRA、AngⅡ、ALD比较（n=6，±s，pg/ml）Table 4 Levels of plasma PRA，AngⅡ，and ALD in different groups

表4 各组大鼠血清中PRA、AngⅡ、ALD比较（n=6，±s，pg/ml）Table 4 Levels of plasma PRA，AngⅡ，and ALD in different groups

注：PRA=外周血肾素活性，AngⅡ=血管紧张素Ⅱ，ALD=醛固酮；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与肾气丸组比较，cP＜0.05

组别 PRA AngⅡ ALD正常组 39.69±5.09 3 700.02±2 109.72 16.19±5.56模型组 45.57±4.58 13 537.64±2 220.04a 91.90±10.66a肾气丸组 39.80±6.56 3 632.11±973.25b 20.56±3.15b苓桂组 43.98±10.20 4 467.87±1 300.66b 32.18±8.70ab肾气丸去苓桂组 37.13±5.48 4 145.29±1 522.77b 40.11±8.01abc F值 1.591 38.421 32.173 P 值 0.208 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

气道黏液高分泌是多种肺部疾病的共同病理表现，现已成为世界范围发病率和死亡率较高的疾病之一［8］，目前对于该病的治疗多以宣肺化痰为主。“夫短气有微饮，当从小便去之，苓桂术甘汤主之，肾气丸亦主之”为仲景治痰饮的代表性原文，文中指出治疗微饮“当从小便去之”，具有深厚的理论基础。如《金匮要略心典》云“气为饮抑则短，欲引其气，必蠲其饮”。“饮、水类也，治水必自小便去之，苓桂术甘，益土气以行水”；“肾气丸，养阳气以化阴，虽所主不同，而利小便则一也”［9］。《高注金匮要略》谓“肾气丸温下以蒸上，而化机亦下被，故小便亦利也”［10］。本研究中桂枝与茯苓相配即为仲景“利小便”药对，全方温阳化饮，行水降逆，痰饮下行，则邪从小便去之，通过对比肾气丸组、苓桂组、肾气丸去苓桂组各项指标的变化，探讨温养肾气、化气利水及二法合用对气道黏液高分泌的干预机制。

本研究结果显示，模型组、肾气丸组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠24 h尿量高于正常组，肾气丸组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠24 h尿量高于模型组，苓桂组大鼠24 h尿量高于肾气丸组，证实3种方剂均可促进模型大鼠排尿，其中苓桂配伍利尿效果最为显著。模型组大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC%、PEF低于正常组，苓桂组大鼠FEV0.3/FVC%低于正常组，肾气丸组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠FEV0.3、FVC、PEF高于模型组，肾气丸组、肾气丸去苓桂组大鼠FEV0.3/FVC%高于模型组，表明3种方剂对大鼠肺功能指标有不同的改善作用，肾气丸、肾气丸去苓桂对大鼠肺功能的改善优于苓桂配伍。

现代研究表明，肺部炎症可导致肾脏受损［11］，肺功能受损可引起肾病综合征、尿频等泌尿系统疾病［12］。多种细胞因子、炎性递质参与调节黏液分泌，其中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α均是重要的气道黏液高分泌相关细胞因子，且其之间存在协同效应［13］。IL-1β能够促进炎性反应，可作用于环磷酸腺苷（cAMP）/激酶A（PKA）通路来上调黏蛋白5AC（MUC5AC）表达，增加黏液分泌［14］。IL-13可通过激活Janus激酶（JAK）/信号转导及转录激活蛋白6（STAT6）通路诱导STAT6的磷酸化，而磷酸化STAT6（p-STAT6）参与杯状细胞化生，导致黏液分泌过多［15］。TGF-α可诱导c-Jun氨基末端激酶（JNK）-肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）活化，进一步上调MUC5AC的表达［16］。TNF-α可以通过介导TNF-α/核因子（NF）-κB通路调节MUC5AC表达，使气道黏液分泌增加［17］。本研究结果显示，模型组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α高于正常组，肾气丸组大鼠BALF中TNF-α高于正常组，肾气丸组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α低于模型组，苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠BALF中IL-1β、TNF-α高于肾气丸组，提示肾气丸可以通过降低BALF中IL-1β、IL-13、TGF-α、TNF-α抑制气道黏液分泌，可能通过调节细胞因子改善大鼠排尿。

气道黏液高分泌可导致肺通气功能的改变，引起缺氧和二氧化碳潴留。长期缺氧可引起血管收缩，循环血量减少，使肾上腺皮质功能改变，分泌肾素，刺激RASS系统，使血清AngⅡ、ALD升高［18-19］。AngⅡ作为前炎性递质的调节者，可通过化学趋化作用使炎性细胞向组织募集；或者识别和直接激活浸润的免疫活性细胞，参与炎性反应，最终导致血管渗透性增加而激发炎症过程［20-21］。本研究结果显示，模型组大鼠血清中AngⅡ、ALD高于正常组，苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠血清中ALD高于正常组，肾气丸组、苓桂组、肾气丸去苓桂组大鼠血清中AngⅡ、ALD低于模型组，肾气丸去苓桂组大鼠血清中ALD高于肾气丸组，提示肾气丸可以明显降低血清中AngⅡ、ALD，其通过抑制AngⅡ、ALD的生成而抑制RASS系统被激活，减少水液重吸收，增加排尿。肾气丸抑制RASS系统被激活可能为“从小便去之”的作用环节之一。虽苓桂组大鼠血清中AngⅡ、ALD高于肾气丸组，但无统计学差异，提示茯苓、桂枝配伍可能通过抑制RASS系统被激活而改善模型大鼠排尿。

综上所述，肾气丸在调控气道黏液高分泌大鼠BALF中IL-1β、TGF-α方面优于苓桂、肾气丸去苓桂；温养肾气、化气利水皆对气道黏液高分泌大鼠具有一定的干预作用，二者合用则效果更佳，即所谓温养肾气和化气利水之药合用则旧饮易去而新饮不留。肾气丸“从小便去之”改善气道黏液高分泌模型大鼠症状可能与其改善肺功能、抑制RASS系统被激活、调节黏液高分泌相关细胞因子有关。本研究为“夫短气有微饮，当从小便去之，苓桂术甘汤主之，肾气丸亦主之”提供了实验室依据，但其中的生物学机制尚有待进一步探讨；“从小便去之”为气道黏液高分泌的有效治疗法则，为临床治疗气道黏液高分泌提供了新的思路，具有进一步深入研究的意义。

作者贡献：许宗颖、钟相根负责文章的构思与设计，进行可行性分析，撰写并修订论文；许宗颖、石少华、于瀚进行研究的实施与数据收集；钟相根对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。