血浆HOXA7基因甲基化在非小细胞肺癌诊断中的应用*

郭丹 杨建伟 杨亮 石科

肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率较高［1-2］，因此寻找有效的肺癌诊断方法具有重要的意义。功能基因的异常高甲基化发生在肿瘤的较早阶段，是肿瘤细胞的一个重要的分子特征，因此可以作为肿瘤早期诊断的分子标志物［3-4］。肿瘤DNA 在细胞自然死亡后被释放到血液或体液中，这些循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）不仅携带着肿瘤细胞的遗传信息，并且保持着表观遗传学上的变化［5］。因此，血浆基因甲基化检测对肺癌诊断具有一定的临床价值。

同源盒基因（homeobox，HOX）是编码转录因子的基因家族，对胚胎的发育具有非常重要的作用。在肺癌和其他类型的肿瘤中，HOX 基因是CpG 岛甲基化的研究热点［6］。HOX 基因家族无论在肺癌细胞系、鳞状Ⅰ期肿瘤，还是混合期肿瘤中都普遍存在甲基化［7］。癌症基因组图谱（TCGA）研究发现HOXA7在肺鳞癌和腺癌组织中存在非常普遍的DNA 甲基化，但在正常的肺组织中却尚未发现［8］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）Ⅰ期和ⅡA 期患者的血浆和痰液中都检测到HOXA7 基因甲基化［9］。但HOXA7基因甲基化在诊断NSCLC中的价值尚不清楚。此外，关于血浆HOXA7 基因甲基化和其他肺癌诊断标志物相关性的研究鲜见报道。因此，本研究通过检测NSCLC 患者血浆中HOXA7 基因甲基化水平，探讨HOXA7 基因甲基化水平与肺癌诊断标志物、肺癌类型、TNM 分期的关系，旨在阐明血浆HOXA7甲基化在NSCLC临床鉴别诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取河南省肿瘤医院2012年1月至2016年12月80例住院的经病理组织学确诊为NSCLC患者为试验组，50例健康人为对照组。入选标准：1）无肺部手术治疗史；2）未经肺癌任何相关化疗、免疫治疗等；3）肺癌为原发性肿瘤并无其他肿瘤病史。入选肺癌患者和健康人群的基本资料见表1，本研究经河南郑州大学伦理委员会批准，并获得患者家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 肿瘤标志物检测 采取患者手术前空腹外周静脉血5 mL，3 000 r/min 离心10 min 取上清液，参照Elecsys 2010电化学发光免疫分析仪及配套的测定试盒（上海罗氏有限公司）使用说明书，使用电化学发光法检测血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、细胞角蛋白19 片段抗原21-1（cytokeratin 19 fragment antigen 21-1，cyfra21-1）和糖类抗原（carbohydrate antigen 199，CA199）水平。

1.2.2 血浆DNA 提取和修饰 抽取患者手术前空腹外周静脉血10 mL于EDTA 抗凝血管中，立即进行3 000 r/min 离心10 min 分离血浆，使用QIAamp DNA Mini Kit（德国QIAGEN 公司）分离血浆DNA，Nanodrop100 核酸定量分析仪（美国Thermo 公司）测定DNA 的纯度和浓度，要求所提DNA 的A260/A280在1.7～1.9 之间。使用EZ DNA Methylation-Gold 试剂盒（美国ZYMO公司）对所提取DNA进行亚硫酸氢钠修饰备用。

表1 肺癌患者和健康人群的基本资料 n（%）

1.2.3 HOXA7 基因甲基化的qMSP 分析 采用定量甲基化特异PCR（quantitative methylation-specific PCR，qMSP）检测患者ctDNA 中HOXA7 基因甲基化水平，引物和探针序列见表2。每个反应体系为25 μL，包括2 μL亚硫酸修饰后的DNA、300 nmol/L正向引物和反向引物、100 nmol/L探针、100 nmol/L荧光染料、1.67 mmol/L dNTPs 和1 mL Platinum Taq DNA 聚合酶（美国Invitrogen 公司）。在96 孔板中每个样本重复3 次。反应条件为95℃5 min，95℃15 sec，65℃1 min，72℃1 min，共50个循环在Step One Plus Real-Time PCR仪（美国Applied BioSystems公司）上进行扩增。HOXA7的甲基化水平的计算采用2-ΔCT表示［9］。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS 23 软件进行统计学分析。构建受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，计算AUC 值用于评估各指标在诊断肺癌中的性能，并计算cutoff值，统计各指标诊断肺癌的灵敏度和特异度。两组之间HOXA7甲基化差异分析用χ2检验。Pearson相关性分析对肺癌组织中各指标之间的相关性。用Medcalc 软件中的Delong 法对不同指标检测NSCLC 的ROC 曲线进行统计学分析。以P＞0.05为差异具有统计学意义。

表2 引物和探针序列

2 结果

2.1 NSCLC患者血浆中HOXA7启动子甲基化检测

通过qMSP 检测NSCLC 患者和健康人群血浆中HOXA7基因启动子甲基化水平，经ROC曲线分析显示，AUC为0.813，95%CI为0.741～0.884，根据ROC制定诊断界值，采用约登指数最大法得到cutoff 值为2.308，HOXA7甲基化诊断NSCLC的敏感度为68.8%（55/80），特异度为86.0%（43/50）。与健康对照组相比，NSCLC患者血浆中发现更高的HOXA7 DNA甲基化水平，且差异具有统计学意义（χ2=36.972，P＜0.000 1，图1）。

图1 血浆HOXA7基因启动子甲基化水平

2.2 血浆HOXA7甲基化与临床病理参数的关系

NSCLC 患者血浆HOXA7 甲基化与性别、年龄和有无吸烟史无关（均P＞0.05，表3），血浆HOXA7甲基化水平在鳞癌患者为71.8%（28/39），腺癌患者为65.9%（27/41），两者比较差异无统计学意义（P＞0.05），但HOXA7甲基化与TNM 分期有关（P＜0.05），其中Ⅳ期患者血浆HOXA7 甲基化水平最高为81.8%（18/22），为Ⅲ期68.6%（24/35）、Ⅱ期67.4%（11/17）和Ⅰ期11.1%（1/9）。

2.3 血浆HOXA7甲基化和肿瘤标志物的相关性分析

经分析HOXA7 甲基化与Cyfra21-1 差异具有统计学意义（r=0.564，P＜0.05）。但HOXA7 甲基化与CA199 和CEA 的相关系数分别为0.202（P＜0.05）和-0.060（P＞0.05），说明HOXA7 甲基化与Cyfra21-1 之间的相关性较好。

表3 血浆HOXA7甲基化与临床病理参数的关系分析

2.4 血浆HOXA7甲基化联合肿瘤标志物检测NSCLC的诊断价值

对3种血清肿瘤标志物进行了ROC曲线分析（图2，表4），AUC值从高到低分别为Cyfra21-1（0.786）、CEA（0.662）和CA199（0.522），其中Cyfra21-1诊断NSCLC的敏感度为70.00%，特异度为90.00%。与3种血清肿瘤标志物相比，HOXA7 甲基化的诊断价值最高（AUC=0.813）。经Medcalc软件分析显示，HOXA7甲基化的AUC与Cyfra21-1相比无显著性差异（P＞0.05），而与CA199和CEA相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。

CEA+CA199+Cyfra21-1三指标联合诊断NSCLC的AUC为0.810，敏感度为65.00%，特异度为94.00%。CEA+CA199+HOXA7甲基化联合诊断NSCLC的敏感度最高为76.25%，Cyfra21-1+HOXA7甲基化联合诊断NSCLC的特异度最高为96.00%。HOXA7甲基化联合三指标（四指标联合）诊断NSCLC的效能最高，AUC为0.893，敏感度和特异度分别为73.75%和94.00%。

表4 血浆中3种肿瘤标志物和HOXA7甲基化对NSCLC的诊断价值评估

3 讨论

肺组织的血管丰富，与外周血液循环的具有紧密联系，所以ctDNA水平和分子特征在肺癌诊断中起着重要的作用。研究显示，肺癌患者的ctDNA水平比正常人高［10］。肺癌组织DNA和血清ctDNA中癌基因和抑癌基因的改变具有高度的一致性［11］，说明检测ctDNA 中特殊分子的改变可以作为一种非侵入性的手段诊断肿瘤，其中研究最多的是基因甲基化［10］。

HOX 基因参与个体发育和细胞分化，在胚胎发育中决定身体节段边界。HOX基因通过调节下游基因的表达，影响细胞的多种生物学功能，如增殖、生存、迁移、分化以及血管的生成［12］。HOX基因家族包括A、B、C和D四个亚族。研究表明，HOXA家族基因在NSCLC 中表达下降，有可能是通过基因甲基化导致的表达下调［6］。HOXA 基因在多种肿瘤中表达异常，参与信号转导通路，如FGF、Wnt、RA 等，与肿瘤的分期和预后有关［13］，其中HOXA7 已成为急性髓性白血病生存率差的预测因子之一［14］，且在早期的肺腺癌和鳞癌组织中普遍都存在HOXA7 基因甲基化［7］，对原发性肺鳞状细胞癌中HOXA基因的甲基化分析发现，HOXA7相关的CpG岛是I期肿瘤中常见的甲基化靶点，肺癌组织中有45.00%HOXA7 CpG 岛发生甲基化［6］。

本研究结果表明，NSCLC 患者血浆中HOXA7 甲基化水平明显高于健康人，与文献报道一致［15］。Hulbert 等［9］报道NSCLC 患者痰液中HOXA7甲基化的诊断效率较高，AUC 为0.77，敏感度和特异度分别为63.00%和92.00%。本研究中血浆HOXA7 甲基化诊断NSCLC 的AUC 为0.813，敏感度和特异度分别为68.80%和86.00%。此外，本研究结果显示，NSCLC患者血浆HOXA7甲基化与性别、年龄、有无吸烟史和病理类型均无关（P＞0.05），但与TNM 分期有关（P＜0.05），从Ⅰ期到Ⅳ期NSCLC患者血浆HOXA7甲基化水平逐渐升高，其中Ⅳ期患者血浆HOXA7 甲基化水平达81.80%（18/22），说明血浆HOXA7甲基化水平与NSCLC的恶性程度有关，参与NSCLC的发生发展。

检测血清中肿瘤标志物的水平因具有快捷、灵敏度高的优点而被广泛用于临床，肺癌标志物有CEA、CA199、Cyfra21-1 等。研究表明，在NSCLC 和SCLC 患者血清中都发现异常高水平的CEA［16-17］，Liu等［18］报道Cyfra21-1是NSCLC 最灵敏的标志物，治疗前Cyfra21-1 水平可以作为SCLC 患者预后差的指标。CEA 和CYFRA 21-1 是诊断肺癌的可靠血清肿瘤标志物［19］。本研究结果显示，Cyfra21-1 诊断NSCLC 的AUC 值最大，敏感度和特异度分别为70.00%和90.00%，CEA 诊断NSCLC 的敏感度和特异度分别为42.50%和72.00%。Okamura 等［20］报道，Cyfra21-1的敏感度和特异度分别为43.00%和89.00%，CEA 诊断肺癌的敏感度和特异度分别为69.00%和68.00%，本研究所用的样本为NSCLC患者血清，说明Cyfra21-1 在诊断NSCLC 有更高的敏感度。此外，本研究结果中CA199 诊断NSCLC 的敏感度较低，仅为23.75%，与Okamura等文献报道一致。

多项肿瘤标志物的联合检测能够提高检测效率［21］，本研究对Cyfra21-1、CA199、CEA 肿瘤标志物联合诊断进行分析发现，NSCLC 的AUC 值增高0.810，敏感度下降至65%，特异度增高至94%。当增加HOXA7甲基化检测指标后，诊断NSCLC的效能最高，AUC 为0.893，敏感度和特异度达73.75%和94%。此外，HOXA7 甲基化与Cyfra21-1 水平具有相关性，说明HOXA7 甲基化可以作为NSCLC 标志物，并且可以提高血清肿瘤标志物诊断的敏感度。

本研究表明，在血浆中检测HOXA7 基因启动子甲基化可获得较高的早期诊断NSCLC 准确性，HOXA7 甲基化和恶性程度相关，联合肿瘤标志物检测可以提高NSCLC的诊断效能。本研究仍需扩大样本量以保证结论的科学性，相信检测血浆基因甲基化可作为CT筛查的辅助工具，识别肺癌高危患者，减少假阳性结果，减少不必要的检测，提高肺癌早期诊断水平。