白木香叶高效液相色谱分析方法的建立及其方法学考察Δ

陈建华，梁林源

(茂名市人民医院药剂科，广东 茂名 525000)

白木香叶为瑞香科植物白木香[Aquilariasinensis(Lour.)Gilg]的非药用部位，含有黄酮、挥发油、苷类及酚类等有效成分[1-4]，每年可采摘2次，产量大。杨晓娟等[5]利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定白木香叶中有效成分的含量，发现白木香叶富含芒果苷，提示今后应深入开展对药用植物非药用部位的综合开发和利用。相关研究结果发现，白木香叶的醇提取物具有降血糖、平喘及抗炎等作用，其效果与白木香药材相当，甚至略优[6-11]。上述研究结果均表明了白木香叶的巨大开发利用价值，因此，建立白木香叶的指纹图谱及质量评价体系尤为重要。本研究旨在建立白木香叶HPLC分析方法并对其进行方法学考察，为白木香叶的指纹图谱研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器

HWS 24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；ME 204型万分之一电子天平、MS 105型十万分之一电子天平(METTLER TOLEOD公司)；安捷伦1200 RRLC型高效液相色谱仪[安捷伦科技(中国)有限公司]；Waters 2695/2988型高效液相色谱仪[沃特世科技(上海)有限公司]；Thermo U 3000型高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技公司)；KQ-700DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

芒果苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111607-201704)；白木香叶(广东君元药业有限公司，批号：20180703)；乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；磷酸、甲酸(分析纯，广州化学试剂厂)；自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液：取白木香叶粉末0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 ml，称定质量，超声(功率250 W，频率40 kHz)提取40 min，放冷，用提取溶剂补足减失的质量，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 对照品溶液：取芒果苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含芒果苷0.2 mg的溶液，即得。

2.2 色谱条件考察

2.2.1 色谱条件：色谱柱为Shiseido CAP Cell MGⅢ C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱(洗脱程序见表1)；流速为1.0 ml/min；检测波长为280 nm；柱温为30 ℃；进样体积10 μl。

表1 白木香叶指纹图谱分析的梯度洗脱程序Tab 1 The elution gradient of fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves

2.2.2 检测波长考察：对供试品溶液进行全波长扫描，从其3D图中选择最佳检测波长。在其他色谱条件不变的情况下，记录供试品溶液不同波长下的色谱图，见图1。结果表明，在280 nm处，白木香叶中色谱峰信息量大，且各峰响应值分布更均匀，最终选择280 nm作为白木香叶指纹图谱分析的波长。

A.供试品3D吸收图；B.波长为280 nm；C.波长为300 nm；D.波长为330 nmA. 3D absorption diagram of the test sample; B. wavelength of 280 nm; C. wavelength of 300 nm; D. wavelength of 330 nm图1 白木香叶供试品3D吸收图及不同波长下的色谱图Fig 1 3D absorption diagram of aquilaria sinensis leaves and chromatograms at different wavelengths

2.2.3 流动相系统考察：依次考察下列流动相系统分析供试品的效果。(1)甲醇(A)-水(B)；(2)乙腈(A)-水(B)；(3)甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；(4)甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；(5)乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；(6)乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。流动相洗脱梯度：0～20～25～35 min，乙腈含量变化8%～40%～8%～8%。其他色谱条件不变的情况下，比较不同洗脱系统对白木香叶的分离效果，以谱图的出峰数目多、峰分布均匀、峰分离效果好和基线平稳为选择标准。结果表明，采用流动相(5)乙腈-0.1%磷酸水溶液得到的供试品溶液的峰信息较多，基线较平稳，分离度、峰形较好，故最终确定流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，见图2。

2.2.4 流动相梯度洗脱程序优化：在其他色谱条件不变的情况下，考察不同梯度洗脱程序对白木香叶分离效果的差异(见表2)，以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀，且主成分峰基本分开为选择标准。结果显示，各梯度的出峰数目基本一致，但梯度6的基线平稳，峰分布均匀，且主成分峰分开效果最佳，

图2 白木香叶指纹图谱分析-流动相系统考察色谱图Fig 2 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-investigation of the chromatogram of the mobile phase system

A.梯度1；B.梯度2；C.梯度3；D.梯度4；E.梯度5；F.梯度6A.gradient 1；B.gradient 2；C.gradient 3；D.gradient 4；E.gradient 5；F.gradient 6图3 白木香叶指纹图谱分析-流动相梯度优化色谱图Fig 3 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the optimized chromatogram of mobile phase gradient

表2 梯度洗脱程序考察Tab 2 Gradient elution procedures was investigated

故选择梯度6，见图3。

2.2.5 供试品溶液进样体积的考察：在其他色谱条件不变的情况下，考察供试品溶液进样体积分别为5、10、15及20 μl时对白木香叶分离效果的影响，以样品色谱图中峰的响应度高且分离度好作为选择标准。结果显示，不同进样体积的色谱图无明显差异，随着进样体积的增加，各峰之间的分离效果逐渐降低，最终选择进样体积为10 μl，见图4。

2.2.6 流速的考察：在其他色谱条件不变的情况下，考察供试品溶液洗脱流速分别为0.8、0.9、1.0、1.1及1.2 ml/min时对白木香叶分离效果的影响，以样品谱图出峰时间适中，主成分峰分离度高、分布均匀作为选择标准。结果显示，当流动相的流速为1.0 ml/min时，供试品的谱图出峰时间适中，峰分离度较高、分布均匀，为最佳流速，见图5。

2.2.7 色谱柱柱温的考察：在其他色谱条件不变的情况下，考察柱温分别为25、30及35 ℃时对白木香叶分离效果的影响，以期通过柱温优化进一步提高峰分离度。结果显示，柱温为20～30 ℃时，各主要色谱峰的分离度差异不大；结合实验实际环境，最终选择30 ℃作为最终的色谱柱温，见图6。

图4 白木香叶指纹图谱分析-进样体积考察色谱图Fig 4 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of different injection volume

图5 白木香叶指纹图谱分析-流速考察色谱图Fig 5 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of different flow rate

图6 白木香叶指纹图谱分析-不同柱温比较的色谱图Fig 6 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of different column temperatures

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察：取白木香叶样品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，取等量洗脱溶剂作为空白供试品溶液。按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果显示，空白供试品溶液在色谱条件下基本无吸收，对供试品的色谱分析无干扰，表明建立的方法专属性好，见图7。

2.3.2 仪器精密度考察：取白木香叶样品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液1份，连续进样6次，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行全谱相似度分析。结果显示，6张谱图相似度均>0.996，主成分峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均<3%，表明仪器精密度符合要求，见表3、图8。

2.3.3 重复性考察：取同一批次白木香叶样品(批号：20180703)，精密称定6份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果显示，6张谱图相似度均>0.993，主成分峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均<3%，表明方法的重复性符合要求，见表4、图9。

图7 白木香叶指纹图谱分析-方法专属性考察色谱图Fig 7 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of specificity study

图8 白木香叶指纹图谱分析-仪器精密度考察色谱图Fig 8 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of the investigation of instrument precision

表3 仪器精密度考察色谱图的相似度Tab 3 Similarity of chromatograms investigated by instrument precision

2.3.4 稳定性考察：取白木香叶样品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液1份，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于放置0、2、4、8、12及24 h时进样分析，记录色谱图。结果显示，6张谱图相似度均>0.998，主成分峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均<3%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定，见表5、图10。

表4 重复性考察色谱图的相似度Tab 4 Similarity of chromatograms investigated by repeatability

2.3.5 方法耐用性考察：(1)不同色谱柱考察。取白木香叶样品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液1份，分别采用Phenomenex C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)、YMC-Triart C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)、Agilent Zorbax SB-Aq C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)和Shiseido CAP Cell MGⅢ C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果显示，4张谱图相似度均>0.992，表明本方法基本适用于不同的色谱柱，见表6、图11。但考察结果提示，不同色谱柱的分离效果仍存在一定差异，Shiseido CAP Cell MGⅢ C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)的分析效果最好，建议指纹图谱分析样品时使用Shiseido CAP Cell MGⅢ C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)色谱柱。(2)不同仪器考察。取白木香叶样品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液1份，分别采用Waters 2695/2998型、Agilent RRLC 1200型和Thermo U3000型液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果显示，3张谱图相似度均>0.995，表明本方法基本适用于不同的液相色谱仪分析，见表7、图12。但考察结果提示，不同的仪器所得图谱仍存在一定的差异，建议指纹图谱分析样品时固定使用同一台液相色谱仪，减小仪器差异造成的样品质量评价误差。

图9 白木香叶指纹图谱分析-方法重复性考察色谱图Fig 9 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of the investigation of method repeatability

表5 稳定性考察图谱的相似度Tab 5 Similarity of chromatograms investigated by test stability

表6 不同色谱柱考察图谱的相似度Tab 6 Similarity of chromatograms investigated by different columns

图10 白木香叶指纹图谱分析-供试品稳定性考察色谱图Fig 10 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of the investigation of test stability

方法学考察结果表明，本研究所建立的白木香叶HPLC分析方法能满足方法学考察要求，且操作简便，可应用于白木香叶的HPLC指纹图谱分析。

图11 白木香叶指纹图谱分析-不同色谱柱考察色谱图Fig 11 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of the investigation of different columns

图12 白木香叶指纹图谱分析-不同仪器考察色谱图Fig 12 Fingerprint analysis of aquilaria sinensis leaves-the chromatogram of investigation of different instruments

表7 不同仪器考察图谱的相似度Tab 7 Similarity of chromatograms investigated by different instruments

3 讨论

目前对白木香叶的研究主要集中在其化学成分上，对其有效成分的指纹图谱研究很少。杨锦玲等[12]通过对国产沉香建立指纹图谱研究，为其科学鉴定和质量控制提供了依据。因此，建立白木香叶的指纹图谱研究对其开发应用具有指导意义。

本研究主要通过HPLC法建立白木香叶指纹图谱分析方法并进行方法学考察，为白木香叶指纹图谱研究提供依据，进一步为其鉴定及质量控制提供标准。参照相关研究建立的沉香高效液相特征图谱分析方法[13-15]，本研究分别对检测波长、流动相系统、流动相梯度洗脱程序、供试品溶液进样体积、流速及色谱柱柱温进行考察，以确定最终的色谱条件；分别从专属性、仪器精密度、重复性、稳定性及方法耐用性考察建立的分析方法，以确保白木香叶HPLC分析方法能够满足方法学考察需求。