万寿菊秸秆用于苹果连作土壤生物修复材料的潜力

王晓芳，赵玉文，王 玫，王海燕，盛月凡，尹承苗，陈学森，毛志泉*

（1 作物生物学国家重点实验室/山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018；2 山东省果树研究所，山东泰安 271000）

苹果连作障碍 (apple replant disease，ARD) 在全世界苹果主产区普遍发生，连作使得苹果园土壤生态环境恶化，果实产量和品质下降，影响苹果产业的可持续发展和食品安全[1]。苹果连作障碍的致病因素复杂，但越来越多的研究表明土传病虫害是导致连作障碍的主要原因。Van等[2]研究发现，在南非连作苹果园中土壤有害真菌镰孢属、柱孢属及腐霉属是引起连作障碍的主要原因；Tewoldemedhin等[3]从连作苹果园腐烂的根中分离到大量的尖孢镰孢菌。但导致连作障碍的因素在不同地区甚至同一地区不同果园也会不同，给连作障碍的防控带来较大困难[4-5]。我国农药使用量持续增加与土传病害的频繁发生密切相关，实现农药使用量零增长，甚至负增长目标，首先必须控制作物土传病害的农药使用量[6]。因此寻求有效的农药替代技术就十分迫切和必要，生物消毒即是在这样的背景下被人们逐渐认识和利用的。

生物消毒对环境无污染，对植物无药害，同时又可以改善土壤肥力，被看作是很有前景的一项甲基溴替代技术。生物消毒一般包括3个步骤：首先，将易分解的有机材料与土壤混匀，然后灌水，最后用塑料膜进行覆盖，其作用机理是诱导土壤形成强还原性的环境来抑制病原微生物[7]。这种生物消毒的方法不仅能够减轻生态和环境风险，有效避免对土壤微生物的不利扰动，同时被证明在抑制多种土传病原菌上有良好的效果，从而提高作物产量[8-11]。近年来关于利用芸薹属植物生物消毒防治土传病虫害的报道较多，在苹果方面也有报道，但利用其它植物生物消毒的报道较少。

万寿菊 (Tagetes erecta) 常用于园林绿化，还可以提取色素，吸收土壤中的重金属镉，提取杀虫杀菌剂等[12]。近年来万寿菊在很多地方的扶贫开发和农业产业结构调整中，升级到了产业化开发种植的行列。范志宏等[13]研究表明，万寿菊根提取物对西瓜枯萎病菌有明显的抑制作用，其中以精油类的抑菌效果最好，且能促进植株生长，有效减轻了西瓜枯萎病菌对植株的毒害作用。万寿菊花采收后剩下的秸秆在生产上利用困难，成为突出的农业环境治理难题，如何综合利用万寿菊生产过程中产生的大量秸秆未见相关报道[14]。虽然万寿菊具有明显的杀菌作用，但利用万寿菊秸秆生物消毒防控苹果连作障碍未见报道。为寻求缓解或克服苹果连作障碍的有效方法，本研究将土壤生物消毒的方法应用到苹果上，以苹果砧木平邑甜茶为试材，探讨不同添加量万寿菊秸秆粉碎物对其生长及连作土壤微生物的影响，系统性地评估生物消毒的方法对苹果连作障碍的综合防控效果，以期为合理利用万寿菊秸秆和减轻苹果连作障碍提供新的方案。

1 材料与方法

1.1 供试土壤和材料

试验于2016年10月—2017年10月在山东农业大学园艺科学与工程学院、国家苹果工程技术研究中心及作物生物学国家重点实验室进行。

供试土壤为棕壤，取自山东省泰安市满庄镇小王庄村26年生红富士苹果园。土壤硝态氮含量5.5 mg/kg、铵态氮含量3.8 mg/kg、速效钾90.6 mg/kg、有效磷9.3 mg/kg、有机质含量5.3 g/kg、pH值6.1。自距树干80 cm处，去表层土后，取10—40 cm深的区域 (根系集中分布区，取根部土壤能较好模拟重茬状态)，多点随机取样，混匀备用。

供试材料为平邑甜茶 (Malus hupehensisRehd.) 实生苗。将平邑甜茶种子于4℃层积30 天左右，待种子露白后，播种于育苗基质中，幼苗长至6片真叶时选取长势一致、无病虫害植株栽植。

供试万寿菊材料 (Tagetes erecta) 于2016年10月取自山东省济宁市嘉祥县老僧堂镇，为当年生万寿菊残株，包括万寿菊秸秆、叶及少量花。全株自然风干，采用粉碎机粉碎，装袋运回泰安，布置盆栽试验前取一部分过3 mm孔径筛，装入封口袋中备用。

1.2 试验处理

试验设置5个处理，设4个万寿菊秸秆粉添加量 (0、12.0、30.0、60.0 g/kg)，秸秆粉与土壤拌匀，均覆盖薄膜。同时追加一个不添加万寿菊粉也不覆膜的对照 (CK)。2017年3月25日进行处理，在每个盆盆底放置滤纸，将不同添加量的万寿菊与连作土拌匀后填盆，然后浇透水，覆膜。处理15天后，揭膜晾7天栽植平邑甜茶幼苗。选取长势一致、无病虫害的 6 叶幼苗移栽到装有6.0 kg土的泥盆中 (盆上口内径23 cm，高18 cm)。每处理20 盆，每盆 2株幼苗，随机排列，正常肥水管理。

1.3 测定指标及方法

生长指标测定：7月10日、8月10日、9月10日分3次取样，每个处理取平邑甜茶幼苗3株，洗净后测定其生物量指标。株高、地径、地上部鲜重采用常规方法测定，叶绿素含量使用SPAD-502型叶绿素计 (Konica Minolta，Japan) 测定。

根系呼吸速率测定：于8月10日取幼苗根系上的新鲜白根，采用Oxytherm氧电极 (Hansatech公司，英国) 测定根系呼吸速率，参照毛志泉等[15]的方法。

光合参数测定：2017年8月20日 (晴天)，上午9—11时用CIRAS-3便携式光合仪 (PP Systems，英国，叶室窗口尺寸 25 mm × 18 mm) 测定平邑甜茶幼苗叶片的净光合速率 (Pn)、气孔导度 (Gs)、蒸腾速率 (Tr) 和胞间CO2浓度 (Ci)，计算水分利用效率(WUE)，WUE = Pn/Tr。每处理随机测定3株，每株测定成熟功能叶 (从上往下数第3～5片叶)，3次重复。控制光强 (1000 ± 50) μmol/(m2·s)，CO2浓度(360 ± 20) μL/L，温度 (26 ± 1)℃[16]。

根保护性酶活性的测定：超氧化物歧化酶(SOD) 活性采用氮蓝四唑 (NBT) 光还原法测定[17]；过氧化物酶 (POD) 活性测定按Omran[18]的方法；过氧化氢酶 (CAT) 活性按照赵世杰[19]的方法。

土壤微生物数量测定：细菌、真菌、放线菌均用稀释平板法测定，测定前计算水分系数。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用马丁氏培养基，放线菌采用高氏一号培养基[20]。

土壤中尖孢镰刀菌基因拷贝数测定：取0.5 g过筛的新鲜土壤，按E.Z.N.A.®土壤DNA提取试剂盒提取DNA。采用实时荧光定量CFX ConnectTMReal-Time System (Bio-Rad，美国) 对土壤中尖孢镰孢菌基因拷贝数进行实时荧光定量分析。实时荧光定量PCR体系依据SYBR Premix Ex Taq TMKit Ta Ka Ra试剂盒说明步骤完成。25 μL PCR反应体系：DNA 模板 1.5 μL，SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，引物各1 μL，dd H2O 9 μL。尖孢镰孢菌PCR扩增反应程序：95℃预变性30 s，94℃变性5 s，60℃退火，72℃延伸30 s，共计40个循环[21]。

末端限制性片段长度多态性 (terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP) 技术分析：提取土壤总DNA后，用真菌ITS区通用片段引物(ITS1-F和ITS4) 进行扩增，用限制性内切酶Hha I对PCR产物酶切，将酶切产物送至生工生物工程(上海) 股份公司进行测序，采用SPSS 19.0软件对测序结果进行真菌群落聚类分析和主成分分析[22]。

1.4 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2003进行数据整理，SPSS 19.0软件进行方差和显著性检测分析。

2 结果与分析

2.1 万寿菊生物消毒对平邑甜茶幼苗生长的影响

添加万寿菊秸秆粉均能明显提高连作条件下平邑甜茶幼苗的生物量，3次取样结果均与CK、0添加量处理的差异显著(表1)。以7月取样测定结果为例，与不添加菊粉处理相比，12 g/kg添加量的株高、地径、地上部鲜重、叶绿素含量分别提高69.4%、6.3%、81.5%、8.2%；30 g/kg添加量的分别提高了183.3%、55.5%、221.5%、17.3%，增加幅度最大；60 g/kg添加量的分别增加55.6%、32.1%、119.5%、10.9%。30 g/kg添加量与12 g/kg、60 g/kg添加量间各指标差异显著，12 g/kg与60 g/kg添加量间差异较小。

表1 不同万寿菊粉用量下平邑甜茶幼苗生长及叶片叶绿素相对含量Table 1 Growth and SPAD values ofMalus hupehensisRehd.seedlings under different marigold powder addition treatments

2.2 万寿菊生物消毒对平邑甜茶幼苗光合参数的影响

测定光合参数时，CK幼苗长势弱，叶片太小，未充满整个测量室，未进行光合参数测定。图1表明，添加万寿菊秸秆粉均提高了平邑甜茶幼苗的叶片净光合速率 (Pn)。与0添加量处理相比，30 g/kg处理的Pn提高了83.6%，12 g/kg和60 g/kg处理的分别提高了25.2%和49.6%，各处理间均差异显著。各处理的气孔导度 (Gs)和蒸腾速率 (Tr)变化趋势同叶片净光合速率，30 g/kg处理与12 g/kg、60 g/kg处理间差异显著，12 g/kg与60 g/kg处理间差异不明显。水分利用效率处理间差异显著，与0添加量处理处理相比，30 g/kg处理的高57.1%，12 g/kg和60 g/kg处理的高16.1%、38.0%。胞间CO2浓度(Ci)各处理间无显著差异。

2.3 万寿菊生物消毒对平邑甜茶幼苗根系呼吸速率的影响

万寿菊秸秆粉处理均能提高平邑甜茶幼苗的根系呼吸速率，与0添加量处理相比，添加万寿菊粉12、30、60 g/kg处理的分别提高了23.4%、56.6%、33.6%，均达到显著性差异。其中30 g/kg添加量处理的增加幅度最大，效果最明显，与12 g/kg、60 g/kg添加量处理间差异显著，12 g/kg与60 g/kg添加量处理间无明显差异(图2)。

2.4 万寿菊生物消毒对平邑甜茶幼苗叶片保护性酶活性的影响

不同万寿菊生物消毒处理对平邑甜茶幼苗根系的SOD活性影响大小不一，但与0添加量处理的均达到显著差异(图3)。其中以添加万寿菊粉30 g/kg处理的SOD活性最高，比0添加量处理的提高48.7%；其次为60 g/kg、12 g/kg处理，分别比0添加量处理的提高36.4%、15.4%，各处理间差异显著。POD和CAT活性变化与SOD变化趋势一致，均表现为30 g/kg的活性最高，比0添加量处理的分别提高113.5%、115.2%。

2.5 万寿菊生物消毒对 土壤微生物数量的影响

与0添加量处理相比，连作土壤中添加万寿菊后，各处理土壤均表现为真菌数量减少，细菌数量增加，细菌/真菌比值变大(表2)。添加万寿菊粉12、30、60 g/kg处理的细菌/真菌比值分别是99.3、265.7、197.3，分别是0添加量处理的1.4、3.7、2.7倍，以添加万寿菊粉30 g/kg处理的差异最大，其次是添加万寿菊粉60 g/kg处理，添加万寿菊粉12 g/kg的比值最小，但均与0添加量处理的差异显著，各添加量处理间也差异明显。

图1 不同万寿菊粉添加处理下平邑甜茶幼苗叶片的光合效率Fig.1 Photosynthetic efficiencies of leaves ofMalus hupehensisseedlings under different marigold powder addition rates

图2 不同万寿菊粉添加处理下平邑甜茶幼苗的根系呼吸速率Fig.2 Root respiration rate ofMalus hupehensisRehd.seedlings under different marigold powder addition

2.6 万寿菊生物消毒对土壤中尖孢镰刀菌基因拷贝数的影响

采用实时荧光定量PCR分析了不同处理土壤中的尖孢镰孢菌基因拷贝数。万寿菊生物消毒处理均显著降低了土壤中尖孢镰孢菌的基因拷贝数(图4)。与0添加量处理相比，添加万寿菊秸秆粉12 g/kg、30 g/kg、60 g/kg处理分别降低了18.6%、57.1%、40.4%，以添加30 g/kg处理的下降幅度最大，且各处理间差异显著。说明万寿菊生物消毒处理后连作土壤中尖孢镰孢菌为主的有害真菌数量明显减少。

2.7 万寿菊生物消毒对连作土壤真菌的T-RFLP分析

图3 不同万寿菊粉添加处理下平邑甜茶幼苗叶片的保护性酶活性Fig.3 Protective enzyme activity in leaves ofMalus hupehensisseedlings under different marigold powder addition

表2 不同万寿菊粉添加处理下土壤的微生物数量Table 2 Population of soil microorganisms in soils under different marigold powder addition

图4 不同万寿菊粉添加处理下土壤尖孢镰孢菌的实时荧光定量分析Fig.4 Real-time quantitative analysis of soilFusarium oxysporumunder different marigold powder addition

图5 不同万寿菊粉添加处理间 T-RFLP 图谱的主成分分析Fig.5 Principle component analysis for T-RFLP patterns under different marigold powder addition rates

由主成分分析 (图5) 和聚类分析 (图6) 可以看出，万寿菊生物消毒对苹果连作土真菌群落结构的响不同。主成分分析结果显示，第一主成分方差贡献率为86.4%，第二主成分方差贡献率为12.8%，两者贡献之和为99.2%，可以代表整个土壤系统的状况。聚类分析可以看出，不同添加量万寿菊生物消毒处理后的真菌群落结构与连作土对照 (CK) 有明显差异，其中12 g/kg处理和0添加量处理的真菌群落结构相近，添加30 g/kg处理的与添加60 g/kg处理的相近。

3 讨论

图6 不同万寿菊粉添加处理间 T-RFLP 图谱的聚类分析Fig.6 Cluster analysis of T-RFLP patterns of different marigold powder addition treatments

长期连作会导致土壤的理化和生物特性发生变化[23]，土壤微生物区系也发生明显变化，主要表现为土壤微生物种群结构、数量以及比例失调，土传病害加重，某些病原菌微生物数量急剧增加，有益微生物大大减少，打破了原有的根际微生态平衡[24]。株高降低、叶面积减小、叶绿素含量降低、光合速率下降等是作物对连作的负反馈[25]。生物消毒 (BSD)处理能促进作物生长、稳产、增产，主要是对土传病虫害的防控作用，其次是改善土壤其他环境因素等[26]。Shrestha等[27]运用Meta-Analysis分析方法，对123份关于生物消毒对作物产量影响的文献进行分析表明，与对照相比，所有BSD处理均能显著提高作物产量。Butler等[28]以糖蜜作为碳源，发现生物消毒处理能确保辣椒 (Capsicum annuum) 和茄子(Solanum melongena) 的产量等于或大于溴甲烷的化学熏蒸消毒。本研究中，万寿菊生物消毒连作土使栽植的平邑甜茶幼苗生物量明显增加，与Mazzola等[9]使用芥菜生物消毒的研究结果一致。说明适量万寿菊生物消毒处理可增强根系长势及抗性，进而促进植株生长发育。同时试验中发现万寿菊施用浓度并非越大越好，添加万寿菊粉60 g/kg处理连作土壤后幼苗生长指标不如添加万寿菊粉30 g/kg处理，可能是因为万寿菊植株残体含有化感物质，过量施用可能会对根系生长和有益生物产生抑制作用；连作土只做覆膜处理也可促进植株生长，但效果不明显。

有研究表明，在一定范围内光合速率随叶绿素含量的增加而增大[29]。逆境胁迫可破坏叶绿体和类囊体膜结构，降低叶绿素合成，抑制光合速率[16]。王志强[30]在桃连作上的研究发现，桃树体生长健壮可以明显抵抗重茬障碍对植株的胁迫作用。本研究也发现万寿菊生物消毒处理的平邑甜茶幼苗生长健壮，叶色深绿，叶片大，叶片相对叶绿素含量明显高于连作土栽植的苗木，净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、水分利用效率等指标都大幅度得到改善 (连作土对照植株长势弱，叶片发黄，叶片小，无法测定光合参数)。研究发现，植株光合速率增加会促进植株生长，水分利用效率提高，可减轻逆境胁迫对叶绿体和类囊体膜结构的破坏，增强抵御逆境的能力。

植物根系是地下部代谢的中心，对根系更新、养分的吸收以及植株生长发育具有重要意义。根系呼吸速率的强弱是植物根系功能和抵御逆境胁迫的重要指标之一[31]。POD、CAT、SOD是保护酶系统的主要酶，在植物遭受逆境时可通过清除活性氧等自由基来减轻对植物细胞膜的伤害作用，是植物抵抗逆境的第一道防线[32]。本研究中，万寿菊生物消毒处理不同程度地提高平邑甜茶幼苗的根系呼吸速率，同时明显提高根系的SOD、POD和CAT活性，从而提高平邑甜茶幼苗抗逆性来缓解连作障碍对植株的胁迫。结合前人研究[12,33-34]分析，一方面万寿菊具有较强抑菌作用，能较好地抑制土壤病原菌，另一方面施入适量万寿菊能改善土壤环境，有利于提高根系的生理功能和吸收功能。

Wu等[35]研究发现长期连作导致土壤瘠薄、香草茎枯萎病的爆发，主要是因为有益微生物的减少和病原真菌的增加。杨永等[36]研究发现长期连作导致哈密瓜土传真菌病害大面积发生，微生物肥料的施用可为防治土传真菌病害发挥积极作用。本研究发现，万寿菊生物消毒显著改变了连作土壤的土壤微生物群落结构，使真菌减少、细菌增加，微生物环境优化，有利于根系生长发育和植株生长。万寿菊生物消毒处理后的土壤真菌群落结构均与连作土对照完全分开，万寿菊粉0添加量处理与12 g/kg添加量处理的聚类在一起，可能是因为低浓度的万寿菊处理效果尚不明显，因此与单独覆膜处理的菌落结构差异不大。添加万寿菊粉30 g/kg和60 g/kg处理的聚类在一起，说明适宜量的万寿菊即可改变真菌结构，过量施用对菌落结构影响不大。万寿菊生物消毒处理的有害真菌尖孢镰孢菌基因拷贝数明显降低，这与Manici[37]的研究结果类似，其研究发现再植苹果幼树前在连作土中种植万寿菊可明显增加土壤中的非致病性真菌，减少有害真菌，从而促进苹果幼树生长。刘星等[38]采用有机物料添加、土壤灌水和表土覆盖相结合的土壤生物消毒方法处理马铃薯连作土壤，发现处理后的连作土中真菌和镰孢菌数量大幅下降。高青海等[39]在研究甜瓜连作障碍问题时也有类似结果，使用秸秆还田有效调节了设施薄皮甜瓜根区土壤微生物区系，改善了土壤微生态环境，从而达到减轻甚至克服连作障碍的目的。

4 结论

盆栽条件下，添加适宜量的万寿菊秸秆粉碎物(30 g/kg) 对连作土进行生物消毒可明显提高平邑甜茶幼苗的生物量，调节根际环境，减少有害真菌尖孢镰孢菌的基因拷贝数，改变土壤微生物群落结构，可作为苹果连作障碍的防控措施。下一步关于万寿菊生物消毒对连作土壤真菌、细菌的影响需要结合高通量测序等方法进行深入研究，也为万寿菊在生产中的应用提供理论依据。