酒萸肉饮片加工炮制一体化工艺△

李清正，张振凌，闫梦真，孟冉

河南中医药大学，河南 郑州 450046

山萸肉为山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，其味酸、涩，微温，具有补益肝肾、收涩固脱之功。临床常用于治疗眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等症。经酒制后，补益肝肾作用增强[1]。山萸肉主要含环烯醚萜类、黄酮类、有机酸类、鞣质类等成分。现代药理研究表明，山茱萸有调节免疫、延缓衰老、抗炎、抗疲劳、降血糖、抗失血性休克和抗艾滋病[2]，还有促进学习记忆、防治骨质疏松、抑制血小板聚集、保肝的作用[3]。目前，市场上流通的山茱萸主要炮制品种包括酒蒸山茱萸、蒸山茱萸、醋山茱萸、盐山茱萸等，且以酒萸肉为主要品种[4]。

传统山茱萸的产地加工方式多采用去核直接进行干燥得到山萸肉饮片，然而上述加工方式在保存过程中存在易变色、发黏、虫蛀等弊端，且不同采收期山茱萸有效成分含量也有所不同，尽量保证在10月份最佳采收期进行采摘，因此亟需新的炮制方法进行优化，以保障山茱萸饮片质量[5]。历代文献对山茱萸的炮制工艺进行了详细的描述，《本草述钩元》云：“酒拌润去核取皮，酒蒸一炷香[6]”；《活幼心书》云：“酒浸润，蒸透，去核取皮为用[7]”；《增广验方新编》云：“酒浸、蒸、晒干[8]”；《炮炙大法》云：“酒拌，砂锅上蒸去核了，一斤取肉皮用，只秤成四两已来，凡蒸药用柳木甄，去水八九寸水不犯上，余悉准此[9]”。由此可见，酒蒸制手段得到酒萸肉饮片，在保存过程中性质稳定。本研究根据古文献的相关记载，结合饮片厂的实际生产需求，以干燥时间、干燥温度、加酒量和蒸制时间为考察因素，采用4因素3水平的正交设计试验，以马钱苷、莫诺苷、没食子酸、5-羟甲基糠醛的含量和酒萸肉外观性状为评价指标，综合评分优选酒萸肉一体化炮制工艺参数，为酒萸肉饮片加工炮制一体化的实际生产提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters 1525高效液相色谱仪(上海通微分析技术有限公司)；Waters2487紫外检测器；25 μL进样针(SGE Analytical Science，Part 003300 25F-LC，25 μL Syringe)；Waters SunFire®C18色谱柱；BT25S型十万分之一天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司，Max=21 g，d=0.01 mg)；DHG-9077A型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；BJ-150型高速多功能粉碎机(德清拜杰电器有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(上海比朗仪器有限公司)；KQ-500DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；YP10002电子天平(上海衡际科学仪器有限公司，Max=1000 g，d=0.01 g)；蒸锅；微电脑电陶炉(额定功率：2200 W)；一次性使用无菌注射器带针(圣光医用制品股份有限公司)；《中国药典》筛(浙江上虞市五四仪器筛具厂)。

1.2 试药

实验用山茱萸新鲜果实购自河南南阳，经河南中医药大学张振凌教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalisSieb.et Zucc.的成熟果实。

没食子酸、莫诺苷、马钱苷、5-羟甲基糠醛对照品(成都普思生物科技有限公司，批号分别为：PS0258-0050、PS0500-0025、PS13031401、PS1517-0100)；黄酒；水为超纯水；乙腈、甲醇均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 酒萸肉产地加工一体化方法的设计与比较

山萸肉在酒蒸过程中，环烯醚萜苷类成分马钱苷和莫诺苷的含量会有不同程度的降低，因此在相同蒸制条件下，以山萸肉外观性状达到《中华人民共和国药典》标准的蒸制最短时间为考察指标，设计了酒萸肉产地加工一体化方法，见表1～2。

表1 酒萸肉加工炮制一体化方法的设计与比较

表1中，按照每100 kg去核鲜山萸肉加25 kg黄酒浸30 min的方法进行蒸制，蒸制2 h后酒萸肉均为腐熟状态，不能达到《中华人民共和国药典》要求的外观性状，所以对一体化炮制工艺的方法进行改进。

表2 改进后酒萸肉加工炮制一体化方法的设计与比较

表2中，按照每100 kg去核鲜山萸肉加25 kg黄酒浸30 min，100 ℃条件下干燥2 h进行蒸制，并记录山萸肉的外观性状，达到《中华人民共和国药典》标准的时间。1号样品蒸制时间在2 h达到《中华人民共和国药典》标准，2号样品在蒸制3 h，3号样品在蒸制4 h后外观性状达到《中华人民共和国药典》标准。2015版《中华人民共和国药典》以马钱苷和莫诺苷的含量为质量控制指标。山茱萸饮片中马钱苷和莫诺苷的含量随着蒸制时间的延长有不同程度的降低[10]。因此，选择1号样品的蒸制条件作为酒萸肉一体化加工炮制方法。

2.2 酒萸肉产地加工一体化工艺参数的优选

2.2.1 试验设计 根据2.1项下酒萸肉产地加工一体化方法的结果，选取干燥温度(A)、干燥时间(B)、加酒量(C)和蒸制时间(D)为考察因素，进行4因素3水平的正交试验，结果见表3。按照正交试验设计表制备酒萸肉样品，取大小均匀的鲜山茱萸去核，分成9份，每份100 g，加入相应量的黄酒浸润30 min，摊开，放入烘箱，在80、90、100 ℃的条件下分别干燥1、2、3 h，取出放入蒸锅内蒸制。

表3 酒萸肉正交试验设计因素水平表

2.2.2 外观性状评分 按照2015版《中华人民共和国药典》[11]“山茱萸”项下“酒萸肉”外观描述“表面紫黑色或黑色，质滋润柔软，微有酒香气”为评分标准，对9组实验样品外观性状评分。

2.2.3 没食子酸、莫诺苷、马钱苷、5-羟甲基糠醛的含量测定

2.2.3.1 供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3.2 对照品溶液的制备 精密称定没食子酸、莫诺苷、马钱苷、5-羟甲基糠醛对照品适量，分别置于10 mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，配制成质量浓度分别为1.022、1.005、0.880、0.030 mg·mL-1的对照品母液。精密吸取各对照品母液0.50、2.00、2.00、1.00 mL，共置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成质量浓度分别为：0.051 1、0.201 0、0.176 0、0.003 0 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.3.3 色谱条件 SunFire®C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.1%磷酸-乙腈(A)梯度洗脱(0～5 min，2%～5%A；5～10 min，5%～10%A；10～30 min，10%～15%A；30～50 min，15%～45%A；50～60 min，45%～100%A；60～70 min，100%～2%A)；检测波长：218 nm(没食子酸)、240 nm(莫诺苷、马钱苷、5-羟甲基糠醛)；柱温：30 ℃；体积流量：1.0 mL·min-1，色谱图见图1。

注：A.混合对照品；B.酒萸肉制品；1.没食子酸；2.5-羟甲基糠醛；3.莫诺苷；4.马钱苷。图1 混合对照品和酒萸肉制品色谱图

2.2.3.4 线性范围的考察 分别精密吸取1、2、4、6、8、10、12、14、16 μL混合对照品溶液，按照2.2.3.3项下色谱条件进行测定。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表4。

2.2.3.5 精密度试验 将一定浓度的混合对照品溶液连续进样6次，每次进样10 μL，分别测得马钱苷、莫诺苷、没食子酸和5-羟甲基糠醛的RSD为：0.34%、0.42%、0.37%和0.53%，表明仪器精密度良好。

表4 没食子酸、莫诺苷、马钱苷、5-羟甲基糠醛4种成分的回归方程及线性范围

2.2.3.6 重复性试验 精密称定样品0.2 g，共6份，按照2.2.3项下制备成供试品溶液，每次进样10 μL，进行分析，测定没食子酸、莫诺苷、马钱苷和5-羟甲基糠醛的峰面积的RSD分别为0.29%、0.61%、1.16%和0.68%。表明方法重复性良好。

2.2.3.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温放置，分别在0、2、4、6、8、24 h分别进样10 μL，测定马钱苷、莫诺苷、没食子酸和5-羟甲基糠醛的峰面积的RSD分别为1.37%、1.23%、1.30%和1.34%，表明供试品溶液24 h内稳定。

2.2.3.8 加样回收率 分别精密称取没食子酸、马钱苷、莫诺苷、5-羟甲基糠醛对照品0.133、1.502、0.869、0.459 mg置10 mL容量瓶内摇匀，作为对照品溶液，精密称取已知含量的正交8号样品0.1 g，共6份，每组按照2015年版《中华人民共和国药典》四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”要求精密加入各对照品溶液，按照2.2.3.1项下制备供试品溶液，按照2.2.3.3项下色谱条件分别进样测定，结果没食子酸、马钱苷、莫诺苷和5-羟甲基糠醛的平均加样回收率分别为98.42%、101.28%、98.37%、98.80%，RSD分别为0.61%、1.78%、0.75%、1.61%，表明该方法准确可靠。

2.2.4 含量测定 将样品干燥，粉碎过三号筛，按照2.2项下方法测定马钱苷、莫诺苷、没食子酸和5-羟甲基糠醛的含量。

2.2.5 结果分析 正交试验结果以马钱苷(A1)、莫诺苷(A2)、没食子酸(A3)、5-羟甲基糠醛(A4)和外观性状(A5)5个指标进行综合评价，用综合指标评分法对正交试验结果进行分析。马钱苷和莫诺苷作为酒萸肉的指标性和有效成分，其含量对酒萸肉质量控制有重要影响，故设定其权重系数分别为0.2，没食子酸和5-羟甲基糠醛设定其权重系数为0.1，酒萸肉的外观性状权重系数为0.4。

综合评分=0.2A1/A1max×100+0.2A2/A2max×100+0.1A3/A3max×100+0.1(0.183-A4)/A4max+0.4A5/A5max×100

(1)

综合加权评分法评价结果见表6。

表5 各成分加样回收率试验结果(n=6)

表6 正交试验设计与结果

表7 方差分析

注：F0.05(2，2)=19.000；*表示差异有统计学意义。

由表7可知，各因素对酒萸肉饮片产地加工一体化的影响顺序是A>D>B>C，其中A因素具有显著性。L9(34)试验直观分析的最佳工艺组合是A3B3C2D1，因此本实验优选的最佳工艺为：每100 kg去核鲜山萸肉加25 kg黄酒浸30 min至透，100 ℃干燥3 h后再蒸1 h，取出，干燥。

2.3 最佳工艺验证

取新鲜山茱萸，平均分成3份，每份1 kg，分别按照上述优选的工艺(每100 kg去核鲜山萸肉加25 kg黄酒浸30 min至透，100 ℃干燥3 h后再蒸1 h，取出，干燥)对酒萸肉饮片中的马钱苷、莫诺苷、没食子酸、5-羟甲基糠醛和外观性状进行综合评分，验证一体化工艺的合理性，评分按照2.2.2项下进行综合评分，结果见表8。

表8 最佳工艺验证结果

由综合评分结果可知，最佳工艺的平均得分为79.953，工艺验证的RSD值为3.60%，以上结果表明，酒萸肉产地加工一体化炮制工艺稳定可行，且马钱苷和莫诺苷的含量高于《中华人民共和国药典》规定的标准，为《中华人民共和国药典》标准的3.79倍。

3 讨论

山茱萸的传统干燥方式主要有晒干和烘干两种方法，无具体干燥工艺参数。酒萸肉的干燥温度控制在80 ℃左右，将新鲜去核的山茱萸在100 ℃下干燥，这实际上已经相当于酒山茱萸的蒸制过程，因此提高了干燥温度就相当于缩短了酒萸肉的再次蒸制时间[12]，因此将干燥温度水平分别设定为80、90、100 ℃。结合酒萸肉的外观性状，蒸制2 h其外观性状可达到《中华人民共和国药典》标准，而传统炮制方法制备的酒萸肉饮片一般4 h以上可达到《中华人民共和国药典》要求，故将蒸制时间水平设定为1、2、3 h。

马钱苷和莫诺苷为2015年版《中华人民共和国药典》[11]中规定的酒萸肉的质量控制指标。郑雪花等[13]通过对没食子酸的研究发现，没食子酸具有抗高血压、抗心肌梗死、抗血管钙化、抗糖尿病、抗肝纤维化、抗肿瘤、抗病毒、抗炎和神经保护作用，其含量经炮制后明显增加。5-羟甲基糠醛(5-HMF)具有抗心肌缺血、抗氧化作用，对急性小鼠肝损伤具有明显的保护作用[14]。5-HMF为糖类加热分解后的产物，经加热炮制后5-HMF的含量明显增加。以上4种成分具有特有的药理作用，因此我们选择以上4种成分作为含量测定指标。

传统山茱萸的产地加工方式多采用去核后直接干燥得到山萸肉，不同的炮制工艺对莫诺苷的含量有一定的影响，在产地加工炮制的全过程中耗费大量时间，而且制备酒萸肉饮片时，需加入黄酒再次进行浸润，会造成有效成分的大量损失。与传统酒萸肉饮片加工工艺相比，一体化加工工艺制备的酒萸肉饮片，于100 ℃的条件下干燥后蒸制1 h，而传统酒萸肉加工蒸制时间为4 h，节省了大量的时间，并有效地保存了山茱萸中的有效成分。不同的炮制工艺对莫诺苷的含量有不同程度的影响[15]，本工艺中马钱苷和莫诺苷含量高于《中华人民共和国药典》规定的标准。以上结果表明，一体化工艺能够缩短酒萸肉饮片的传统加工炮制周期，降低贮藏保管难度，提高酒萸肉饮片质量，且工艺简单、稳定、可行，可为酒萸肉饮片的一体化生产提供参考。