桑枝多酚的制备与其抗氧化活性成分研究△

刘鑫彤，孙登阳，叶世芸，唐崇明，曹俊东，3*，周胜，刘江云

1.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002；2.苏州大学医学部 药学院 中药系，江苏 苏州 215123；3.云南省第一人民医院 药学部，云南 昆明 650032

桑属植物桑MorusalbaL.是一种常用中药，最初在《神农本草经》中有记录，它的根也就是桑白皮，枝叶及果实等均可作为药用。桑枝为桑的干燥嫩枝，《中华人民共和国药典》中记录了桑枝对于风湿、关节病有一定疗效，可用来治疗湿痹浮肿的症状。众多学者从其枝皮中分离出了黄酮类、生物碱类等化合物。已有实验表明，桑枝可以降压、抗菌、明目，其药理活性包括抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、心血管保护和免疫调节等[1]。

中国地大物博，是桑树的产地之一，桑枝资源丰富、有深入开发利用的空间[1]。近年来对桑枝中生物碱、总黄酮等活性生物资源的研究与开发利用受到我国学者的关注[3-6]。本课题前期对桑枝中桑皮苷A、桑皮黄素两种主要成分的含量分析方法进行了研究，发现桑枝多酚的含量与具体品种、采收期有明显关联[7]。本文报道桑枝多酚的制备及其抗氧化作用，为桑枝的进一步研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

岛津LC-20A高效液相色谱仪；ODS色谱柱(5C18-AR-Ⅱ，250 mm×4.6 mm，日本Cosmosil公司)；BP-Purifier-100中压液相系统(利穗科技苏州有限公司)；Avance Ⅲ plus 400 MHz核磁共振仪(德国Bruker Daltonics公司)；UV-SPD-M20A紫外分光光度计(日本岛津公司)；ME215S型电子天平(德国Starorious公司)。

1.2 试剂

AB-8等大孔树脂(西安蓝晓科技有限公司)；硅胶300～400目(青岛海洋化工有限公司)；ODS硅胶(75 mm，日本Cosmosil公司)；甲醇(色谱纯，上海化学试剂有限公司)；纯净水；去离子水(自制)；乙醇、过硫酸钾、甲醇等其他试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

桑皮苷A对照品(纯度97.2%)、桑皮黄素对照品(纯度94.5%)由本实验室自制，经NMR、UV数据进行鉴定，其纯度采用液相峰面积归一法计算；DPPH(1，1′-二苯基-2-三硝基苯肼)和ABTS(2，2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐购自日本东京化成工业株式会社。

桑枝(批号：MA121010)于苏州大学摘取，经苏州大学谈建中教授鉴定为桑科植物桑MorusalbaL.的枝条，本实验选用已干燥的桑枝皮进行研究。

2 方法

2.1 多酚的提取

取桑皮样品500 g，75%乙醇回流提取2次，1.5 h/次，加醇量为5 L，将两次滤液混合，减压浓缩至250 mL(相当于2.0 g生药材/mL；MAP-1)，上AB-8大孔树脂柱(100 cm×10 cm)，依次用水(5 L)、40%乙醇水(6 L)、90%乙醇水(10 L)洗脱(2 BV·h-1)，分别收集洗脱液，减压浓缩，干燥，分别得到相应柘木多酚样品MAP-2(2.3 g)、MAP-3(0.28 g)。

取MAP-2样品1.5 g，用20%甲醇25 mL超声溶解，上中压C18反相柱(40 cm×7 cm)，用20%甲醇洗脱(25 mL·min-1)，检测波长为303 nm。收集色谱主峰1，并经HPLC检测纯度，单体流分合并、浓缩干燥，得到化合物1(380 mg，纯度90.2%)。

取MAP-3样品0.2 g，用68%甲醇5 mL超声溶解，上中压C18反相柱(40 cm×7 cm)，用68%甲醇洗脱(25 mL·min-1)，检测波长为303 nm。收集色谱主峰2，并经HPLC检测纯度，单体流分合并、浓缩干燥，得到化合物2(44 mg，纯度95.3%)。

2.2 桑枝多酚的大孔树脂精制工艺

参考本课题组前期文献方法[8]，首先采用静态法进行大孔树脂筛选。将8种树脂处理后，取适量(相当于干质量1.0 g)放入锥形瓶中，加25 mL提取液，在恒温振荡箱中摇晃6 h(25 ℃、180 r·min-1)后，抽滤得滤液测定吸附率；饱和树脂加25 mL 95%乙醇，相同条件下恒温振荡6 h，取解吸液用于液相检测解吸附率。

采用动态吸附与解吸附实验，优化AB-8大孔树脂洗脱工艺。称取相当于4.0 g干质量的AB-8湿树脂装柱(20 cm×1.5 cm，10 mL·BV-1)，取样品提取液适量上样，用适量设计的待考察乙醇浓度、体积洗脱，流速为0.5 mL·min-1，5 mL收集一次，HPLC测定流出液中桑皮苷A、桑皮黄素的含量。

HPLC条件：流动相：乙腈(A)-1%乙酸水(B)，梯度洗脱(0～15 min，7%A；15～30 min，7%～43%A；30～45 min，43%A；45～50 min，43%～70%A)；检测波长为303 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1；进样量为20 μL[7]。采用峰面积(Y)和样品质量浓度(X，mg·mL-1)进行含量计算，桑皮苷A和桑皮黄素的线性方程分别为Y=8 110.3X-21.429(0.101 5～2.029 mg·mL-1，r=0.999 8)、Y=9 849.3X+81.679(0.020 42～0.408 4 mg·mL-1，r=0.999 7)。

2.3 抗氧化活性测试

参照本课题组前期文献方法[9]进行，以维生素C作对照。各测试样品溶液质量浓度为0.1～1.0 mg·mL-1；桑皮苷A和维生素C为0.01～0.1 mg·mL-1。用分光光度计测定DPPH·(517 nm)或ABTS·(734 nm)的吸光度Ai。并按下列公式计算各样品对自由基的清除率。

自由基清除率(%)=[1-Ai/Ab]×100

(1)

其中Ai为加入样品反应后溶液的吸光度值，Ab为未加样品的DPPH·或ABTS·工作液的吸光度值。

3 结果

3.1 多酚主成分鉴定

按上述方法制得桑枝多酚MAP-1～3。MAP-2、3再各经中压反相色谱柱进一步分离，分别获得化合物1、2。

化合物1：暗红色粉末，易溶于甲醇、水等溶剂。

1H-NMR(CD3OD，400 MHz)：δ7.43(1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，7.34(1H，d，J=16.4 Hz，H-α)，6.95(1H，d，J=16.4 Hz，H-β)，6.63(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-5)，6.61(2H，m，H-2′,6′)，6.60(1H，m，H-3)，6.46(1H，dd，J=2.0，2.0 Hz，H-4′)，4.91(1H，d，J=7.8 Hz，H-1″)，4.88(1H，d，J=7.8 Hz，H-1‴)。13C-NMR(CD3OD，100 MHz) ：δ120.4(C-1)，150.1(C-2)，105.1(C-3)，156.9(C-4)，108.5(C-5)，128.4(C-6)，127.8(β-C)，126.0(α-C)，142.0(C-1′)，107.3(C-2′)，159.6(C-3′)，104.1(C-4′)，157.1(C-5′)，108.1(C-6′)，102.3(C-1″)，102.5(C-1‴)，74.9(C-2″，2‴)，78.1(C-3″，3‴)，71.5(C-4″，4‴)，78.2(C-5″，5‴)，62.6(C-6″，6‴)。

以上数据与文献报道[10]对照一致，鉴定为桑皮苷A。结构参见图1。

化合物2：黄色粉末。

1H-NMR(CD3OD，400 MHz)：δ7.07(1H，d，J=2.0 Hz，H-3′)，6.42(2H，brs，H-5′，6′)，6.23(1H，s，H-6)，5.21(1H，t，J=7.2 Hz，H-17)，5.16(1H，t，J=7.2 Hz，H-12)，3.58(2H，d，J=7.2 Hz，H-16)，3.10(2H，d，J=7.2 Hz，H-11)，1.60，1.59，1.58，1.54(each 3H，s，H-20，15，19，14)。13C-NMR(CD3OD，100 MHz)：δ157.9(C-2)，121.5(C-3)，184.1(C-4)，157.1(C-5)，99.0(C-6)，163.9(C-7)，107.6(C-8)，162.6(C-9)，103.9(C-10)，24.8(C-11)，123.4(C-12)，132.6(C-13)，17.5(C-14)，25.8(C-15)，22.4(C-16)，123.0(C-17)，132.0(C-18)，17.7(C-19)，25.9(C-20)，113.7(C-1′)，160.7(C-2′)，105.5(C-3′)，161.2(C-4′)，107.9(C-5′)，132.4(C-6′)。

以上数据与文献[11]基本一致，鉴定为桑皮黄素。参见图1。

图1 桑皮苷A(1)和桑皮黄素(2)结构

3.2 桑枝多酚的大孔树脂制备工艺研究

大孔树脂的吸附性和其化学物理性质有关，例如结构、比表面积等。选用8种常用大孔树脂进行筛选。其对桑皮苷A和桑皮黄素的吸附特点见表1。

表1 桑枝提取液中2种主成分的静态吸附和解吸附数据

由表1可知，所测试各型树脂中，非极性(D101、LX-60)、弱极性(AB-8、LX-68G)树脂对桑皮苷A和桑皮黄素吸附效果均较好；而极性树脂和中极性树脂对其吸附效果相对较差。进一步从解吸率分析，非极性树脂均不如弱极性树脂AB-8，其原因可能为桑皮苷A、桑皮黄素中的多酚类基团容易和非极性、弱极性树脂结合，因而吸附率高；解吸附时非极性树脂由于与溶质的分子间作用力强，更难解吸附。综合比较，最终优选AB-8树脂。

采用动态实验，对AB-8树脂柱纯化桑枝多酚的制备工艺参数进行考察和优化，包括上样液浓度和体积、洗脱液比例和体积等。其中，洗脱液中乙醇比例对两种成分解吸附的作用见图2。由图可见，树脂柱中吸附的桑皮苷A容易被20%～40%乙醇解吸附；桑皮黄素较难洗脱，60%～100%乙醇均有解吸附量。经多个单因素考察试验研究，获得优化的制备工艺参数：最佳上样浓度和上样体积为2.0 g生药/mL共10 mL；洗脱剂选择用水5倍体积洗去杂质，40%乙醇溶液4倍体积洗脱桑皮苷A，90%乙醇溶液6倍体积洗脱桑皮黄素。

图2 洗脱剂中乙醇浓度与桑皮苷A及桑皮黄素动态解吸附关系

采用液相分析，测定桑枝多酚MAP-1中桑皮苷A、桑皮黄素的质量分数分别为23.7%、7.63%。经AB-8树脂精制后，MAP-2中桑皮苷A的质量分数为40.5%，MAP-3中桑皮黄素的质量分数为43.8%。各样品液相色谱见图3。

3.3 抗氧化活性

使用DPPH、ABTS两种分析方法，对桑枝多酚MAP-1～3、桑皮苷A、桑皮黄素的抗氧化活性进行测定(对照品为维生素C)。各样品对两种自由基的IC50值见表2。桑枝多酚MAP-1～3、桑皮苷A、桑皮黄素均对DPPH、ABTS两种自由基具有清除作用，其中桑皮苷A活性更强，可能与其具有优良的溶解性有关。

注：1.桑皮苷A；2.桑皮黄素。图3 桑枝多酚MAP-1～3样品HPLC图

表2 各样品对DPPH和ABTS自由基的半数清除率(IC50) mg·L-1

4 结论

桑枝中成分组成复杂，其中多酚类成分是其主要有效成分之一。桑枝及柘木等同科植物中富含桑皮苷A等白藜芦醇类抗氧化活性成分[8]，相关报道较为丰富[1，5-6，9]；其他特征性的异戊烯基取代黄酮类成分组成复杂、结构多变，但相对含量低，报道较少[1]。本课题前期HPLC检测结果表明，桑枝多酚中的主要成分为桑皮苷A和桑皮黄素[7]。本文进一步报道其该成分分离鉴定过程和抗氧化活性测试结果，为相关研究工作提供参考。

桑枝多酚的提取和大孔树脂精制工艺已有相关文献报道[3-5]，但主要以总黄酮、桑皮苷A为指标成分进行研究，桑皮黄素等弱极性成分在精制过程中的含量变化未见报道。为此，本文采用大孔吸附树脂法，进一步研究建立基于该2种主成分含量变化的桑枝多酚相关精制工艺参数，为后期研究与开发利用提供参考。研究结果表明，分别采用40%、90%乙醇洗脱，可以制备获得较高纯度的桑枝多酚MAP-2～3，工艺简洁可行。在本实验研究中，还参考课题组前期研究方法[8]，就AB-8树脂对2种目标产物的静态吸附动力学曲线(25 ℃条件下)成分进行测定，结果表明，准二级反应动力学模型模拟最佳(r=0.999 8)，表明吸附剂和吸附质均是决定吸附速率的主要因素。对不同上样液浓度时该2种成分的吸附等温线进行测定，结果表明，Langmuir(r>0.995)和Freundlich(r>0.986)吸附等温线方程均适用于描述溶质分子与树脂作用的过程；Langmuir方程表明，2种溶质在低、中压力范围内AB-8树脂的吸附均属于单分子层吸附。