不同免疫学检验方法对混合精斑的检测及应用

董敏安，李美丽，蔡铭升

（1.广州医科大学基础医学院，广东 广州 510000；2.湛江市公安局，广东 湛江 524000）

法医学鉴定中，精斑是性犯罪的重要证据之一，其作用不可替代[1]。实际工作中，检材常常存在精斑混合血斑、多人精斑混合、精子量过少等情况，常规的差异裂解法不能解决上述问题[2]。本研究通过前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）胶体金免疫试纸条法、免疫磁珠法以及激光捕获显微切割技术分别对混合精斑进行处理和检验，以单一精斑作为对照，并将上述方法联用于实际案件，以期为混合精斑的分离确证及研究更好的检验方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本

本研究精液样本来自3名健康男性志愿者。在3名志愿者的精液样本中各吸取1 mL分别滴于棉质内裤的不同位置，制成3份纯精斑样品。再从3名志愿者的精液样本中各吸取0.5mL加入同一个离心管中，置于涡旋振荡器上充分混合后，滴在上述棉质内裤的空白区域上，制成3名志愿者的混合精斑样品。样品阴干后置于25℃室内环境保存备用。同时检测3名志愿者的血样作为分型参照。

1.2 PSA胶体金免疫试纸条法

分别剪取1cm×1cm纯精斑和混合精斑样品置于不同离心管中，各加入900μL TNE缓冲液，置于涡旋振荡器上振荡10min，将PSA胶体金免疫试纸条插入离心管内（液面不超过试剂条上的标志线），5 min内观察结果。剪取内裤空白区域，重复以上步骤作为阴性对照。

1.3 免疫磁珠法

1.3.1 模拟差异裂解法第一步制备精子沉淀物

分别剪取1cm×1cm纯精斑和混合精斑样品置于不同离心管中，各加入 900 μL TNE缓冲液、100 μL 10%十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）溶液、20 μL 10 mg/mL蛋白酶K，混匀后置于56℃恒温干浴仪中消化3 h，模拟差异裂解法第一步去除女性上皮细胞的过程。振荡10 s，去除载体，转移全部消化液至另一个离心管中，以16000×g离心5min，去掉上清液，加入900 μL TNE缓冲液，以16 000×g离心5 min，去掉上清液，加入700 μL去离子水，振荡10 s后以16000×g离心5min，重复水洗2次，即得精子沉淀物。

1.3.2 常规差异裂解法第二步提取精子DNA

将精子沉淀物置于离心管中，加入160 μL 5%Chelex-100螯合树脂、20 μL 10 mg/mL的蛋白酶K、8μL 1mol/L二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT），混匀后置于56℃恒温干浴仪中孵育3h，振荡10s，置于98℃恒温干浴仪中孵育10min，振荡10s后以16000×g离心5min，取100μL上清液，使用QIAquick PCR Purification Kit（德国Qiagen公司），按照说明书操作提取得到上述样品的DNA作为对照样品，于-20℃保存。

1.3.3 免疫磁珠法替代第二步提取精子DNA

用ML-超微量磁珠法DNA提取试剂盒（长春市博坤生物科技有限公司）在KingFisherTM自动纯化系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）上进行提取。在上述精子沉淀物中分别加入250 μL试剂盒配套胍盐裂解液、20μL 10mg/mL蛋白酶K、8μL 1mol/L DTT，振荡10s，56℃下孵育3h，按ML-超微量磁珠法DNA提取试剂盒操作说明书，分别将含裂解液的混合溶液平均移至试剂盒配套试剂条（封装有试剂的塑料条，A、B、C孔为加样孔，D、E、F孔为漂洗孔，G孔为磁珠孔，H孔为洗脱孔）的A、B、C孔上，在H孔中加入30 μL去离子水，置于KingFisherTM自动纯化系统上，装好磁套，按操作规程完成自动提取纯化，最终得到约25μL的DNA产物。

取1 μL上述DNA提取产物，使用PowerPlex®Y23系统（美国Promega公司）进行扩增，采用10 μL扩增体系，以DNA标准品2800M作为阳性对照，在3100-Avant基因分析仪（美国AB公司）上进行电泳。

1.4 激光捕获显微切割技术

分别剪取1cm×1cm纯精斑和混合精斑样品置于不同离心管中，浸泡于900μL去离子水中，37℃下振荡孵育30min，去除载体，以16000×g离心3min，去掉上清液，留约50μL液体，振荡混匀，涂于聚萘二甲酸乙二醇酯（polyethylene naphthalate，PEN）覆膜玻片上，载玻片在室温下自然干燥后，用激光捕获显微切割系统（德国Zeiss公司）进行捕获。

在镜下对样本中单个精子进行切割，并弹射到加了0.75 μL含有0.1 mg/mL蛋白酶K和5 mmol/L DTT的裂解液的AG480F AmpliGrid微量反应玻片（美国Beckman Coulter公司）的反应位点上，用封闭油封闭。每个反应位点收集1个精子细胞，每个精斑样品分别捕获96个精子细胞，56℃裂解2h，99℃变性10min。AG480F AmpliGrid微量反应玻片在使用前置于紫外交联仪（国产）内，紫外交联2min，以防止DNA污染。

使用PowerPlex®Y23系统（美国Promega公司）对上述DNA提取产物进行低体积扩增，采用0.75 μL+0.75μL扩增体系，以DNA标准品2800M作为阳性对照，选取覆膜玻片上无细胞区域作为阴性对照，在3100-Avant基因分析仪（美国AB公司）上进行电泳。

1.5 数据处理

用GeneMapperIDv3.2软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）对获得的STR数据进行分析。以等位基因峰值大于200相对荧光单位（relative fluorescence unit，RFU）为基因座可判型标准，本研究以检出不少于13个等位基因为有效分型。计算分型成功率、非特异扩增率、等位基因丢失率。分型成功率=有效分型次数/重复次数；非特异扩增率=出现非特异性扩增的基因座/（23×重复次数）；等位基因丢失率=等位基因丢失条带总数/（3人检测血样得出的Y-STR条带数相加×重复次数/3）。

对于没有获得完整分型的数据，把多次捕获后获得的分型进行综合分析处理，将结果相互印证、叠加（对结果进行分类，把类似的结果归一，用已检出位点填补未检出位点的数据，再跟另外一个类似结果的样本作比对）。

2 结 果

2.1 PSA胶体金免疫试纸条法检测情况

所取3份纯精斑和1份混合精斑样品经PSA胶体金免疫试纸条法检测，结果见各样本在测试区和控制区内均出现一条紫红色条带，提示4份检材均含有人精液PSA，阴性对照未见阳性反应。

2.2 常规差异裂解法检测情况

所取3份纯精斑和1份混合精斑样品检出的STR分型结果中，RFU值较低，非特异扩增较多，部分基因座未能获得STR分型，甚至未检出结果。

2.3 以免疫磁珠法替代常规差异裂解法检测情况

经KingFisherTM自动纯化系统完成自动提取纯化的4份样品的STR分型结果中：3份单一精斑样品均得到完整STR分型结果，RFU值在3000～6000，杂合子及单荧光色各峰值间高低均衡无杂带；1份混合精斑样品经免疫磁珠法提取后扩增，得到混合Y-STR分型。混合精斑Y-STR分型见图1。

图1 混合精斑样品的Y-STR分型图谱

2.4 激光捕获显微切割技术检测情况

3份纯精斑样品分别捕获96个精子细胞，共288个样本，经扩增分别获得40、38、28共106种分型，除了直接获得的完整分型外，把多次捕获后获得的分型综合分析处理，获得的3名志愿者的分型与经免疫磁珠法提取的Y-STR分型结果一致。分型成功率为84.00%，总体分型情况见表1。非特异扩增率为1.47%，等位基因丢失率为25.40%。

利用激光捕获显微切割技术捕获混合精斑上的单一精子细胞，低体积扩增后得到单一Y-STR分型。

表1 单一精斑的Y-STR分型结果

2.5 案例应用

2.5.1 简要案情

某地发生一起杀人案，中心现场周围遗留大量物证。由于死者为女性，按照常规提取女性死者的阴道擦拭物，内裤、身体上的可疑斑迹，并在现场寻找相关的物证，以证明死者死前是否有性行为，为案件的侦查提供方向。

2.5.2 检验方法

按上述PSA胶体金免疫试纸条法对现场检材进行筛选，选出阳性结果的有效检材，并选取阴性结果的检材作为对照。

把上述阳性及阴性结果的检材按1.3中所述方法处理后，进行后续的扩增和电泳。

把死者阴道擦拭物应用差异裂解法第一步消化女性上皮细胞后用激光捕获显微切割技术对单精子进行捕获，进行低体积扩增和电泳。

2.5.3 结果

经PSA胶体金免疫试纸条法检测，女性死者的阴道擦拭物、内裤以及现场树叶上提取的可疑斑迹在测试区和控制区内均出现一条紫红色线条，提示为阳性结果，身体上的可疑斑迹以及其他相关物证仅在控制区内出现一条紫红色线条，提示为阴性结果。

检材经超微量免疫磁珠法配合差异裂解法处理后扩增，现场树叶上提取的可疑斑迹中检出单一Y-STR分型，死者阴道擦拭物及内裤均检出混合Y-STR分型，不排除包含现场树叶上可疑斑迹中检出的Y-STR分型。

利用激光捕获显微切割技术分离混合精斑，经3130xl基因分析仪（美国AB公司）电泳后，经综合分析处理，获得两名男性的Y-STR分型，其中一名男性的Y-STR分型与现场树叶上提取的可疑斑迹检出的单一Y-STR分型相同。

2.5.4 案件侦查情况

获得两名嫌疑人的Y-STR分型后，对现场周边村落的不同家族各提取一名男性血样进行排查，树叶上可疑斑迹检出的Y-STR分型与某村中一王姓家系的Y-STR分型成功匹配，对精斑检材提取产物加做常染色体STR检测后，继续对该家族内适龄男性取血样进行排查，最终认定了嫌疑人王某。在证据面前，王某供认了其强奸杀人的犯罪事实，案件得以快速破获。Y-STR检测技术在该案件中起到了重要作用。后经继续侦查查明，混合精斑内另外一名男性的YSTR分型与女性死者丈夫的Y-STR分型一致。

3 讨 论

在案件的实际应用中，由于某些类型的案件检材量非常大，如何快速选定有效检材是DNA检验工作中的重点，关系到能否以最快的速度获取嫌疑人的信息从而破获案件。在性犯罪中，含有精斑的检材是检验的重点，应用PSA胶体金免疫试纸条法可从大量繁杂的检材中批量进行筛选，从而获得有效的精斑检材，大大节省实验时间[3]。差异裂解法是当前检测精斑的方法中比较简便和高效率的方法，但是由于检材中可能存在抑制后期扩增和电泳的物质，常常使分型图谱不理想，应用免疫磁珠法替代差异裂解法第二步的回收步骤，可有效去除检材中的杂质，提高精子DNA的提取效率，获得高纯度的DNA，有利于扩增和电泳[4]。针对精斑检材中可能存在的混合精斑，传统方法无法快捷地分离出单一的STR分型，应用激光捕获显微切割技术对混合精斑中的单一精子进行捕获[5]，经低体积扩增并对结果进行综合分析处理后，可获得完整的单一STR分型。值得一提的是，经过去除女性上皮细胞后再进行激光捕获显微切割，可有效减少上皮细胞对捕获精子所带来的影响，但同时在消化清洗的过程中，精子细胞也会出现丢失，因此，将激光捕获显微切割技术应用在精子量本来就少的检材中时要慎重[6]。

在本次案例应用中，应用PSA胶体金免疫试纸条法对案件检材进行快速筛选，得到有效的精斑检材后，用差异裂解法对精斑进行消化，用免疫磁珠法替代消化第二步，电泳发现有混合分型，再用激光捕获显微切割技术对此类检材进行进一步处理，最终获得单一Y-STR分型。需要注意的是，Y-STR呈父系遗传，因此同一父系内的所有男性个体均具有同样的Y-STR，因此并不能根据Y-STR分型结果进行个体识别，其主要作用在于家系排查，可结合常染色体STR检测技术，依靠统计学方法，对个体进行精准识别。