基于分子对接方法研究山核桃叶黄酮单体对痛风关节炎中NLRP3炎症信号通路的作用

浙江中医药大学 杭州 310053

痛风是由体内嘌呤代谢紊乱导致尿酸生成增多和（或）尿酸排泄减少所引起的一种慢性低毒性炎症反应性疾病，特征为尿酸盐沉积，表现为关节红肿、疼痛，并发痛风石沉积、关节畸形、肾功能不全等症状，严重危害人们健康。研究表明，沉积的尿酸盐结晶被固有免疫识别受体结合后能够启动寡聚化结构域样受体3（nucleotide-binding oligomerization domain leucine rich repeat and pyrin domain containing 3，NLRP3）炎症信号通路，从而刺激机体产生炎症因子，介导炎症反应[1]。临床治疗药物如秋水仙碱，可作用于NLRP3炎症信号通路治疗痛风，但存在较大的不良反应[2]，因此新药物的开发仍是痛风研究的热点。某些抗炎中药能够有效防治痛风性关节炎，而且成分天然、不良反应少，引起了研究者的广泛关注[3]。

既往研究证实，痛风性关节炎模型小鼠的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）、NLRP3、天冬氨酸半胱氨酸特异性蛋白酶-1 （cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）含量增加[4]。邢志华等[5]研究发现，黄酮类化合物葛根素可防治痛风性关节炎。进一步研究发现，半枝莲总黄酮可通过抑制NLRP3炎症信号表达，降低炎症效应[6]。以上实验研究的结果，与含黄酮类成分的中药具有清热祛湿、化瘀通络的功效相呼应，因此，笔者推测含有黄酮成分的中药可能是治疗痛风性关节炎的潜在新药[7]。中药的抗炎作用具有多靶多效的特点，但是其组成成分复杂，靶标关联不明确，导致在分子水平研究中药抗炎机制的报道较少。而以计算机软件为基础的分子对接技术可立足于中药已知成分，将中药成分和炎症蛋白进行模拟对接，推测药物作用机制，该项技术已被广泛应用于中药抗炎活性成分的筛选和作用靶标的确定[8]。本文利用分子对接技术，以山核桃叶总黄酮中的5种主要单体汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素查尔酮、松属素[9]为配体，与NLRP3炎症通路信号蛋白进行半柔性对接，研究山核桃叶黄酮单体对NLRP3炎性体及其通路信号的作用靶点，明确山核桃叶黄酮单体抗痛风药效的物质基础及作用机制，为痛风性关节炎提供药物治疗的新方向。

1 材料和方法

1.1 黄酮配体收集与建立 利用软件ChemBioDraw构建山核桃叶总黄酮中各单体的平面结构：小豆蔻明（cardamonin）、白杨素（chrysin）、松属素（pinocembrin）、球松素查尔酮（pinostrobin Chalcone）、汉黄芩素（wogonin），结构式如图1所示。将其保存为CDX文件，导入软件ChemBio3D中呈现其三维立体结构，利用分子力场MM2简单优化后设置动力学模拟参数进一步优化，并对优化后的分子进行类药性质分析。

图1 5种黄酮单体的化学结构式Fig.1 Chemical structure of five flavonoids monomers

1.2 蛋白受体收集与建立 查阅文献，收集与NLRP3通路相关的报道，了解到NLRP3信号传递不仅和NLRP3炎性体有关，还与钾钙离子浓度、细胞表面嘌呤受体P2X配体门控的离子通道7（purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7，P2X7）、乙酰化微管蛋白、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、花生四烯酸代谢等路径存在联系，最终确定了22个与NLRP3信号通路相关的蛋白，从RCSB数据库（http：//www.rcsb.org/pdb）中筛选对应的人源受体靶点蛋白[10]。见表1。

1.3 分子对接流程 利用软件Discovery Studio 2.5预处理靶蛋白，处理完毕后以PDB格式存储，得到半柔性蛋白。用软件Auto Dock进行分子对接，先后导入经ChemBio3D处理的山核桃叶黄酮单体以及经Discovery Studio 2.5预处理的靶点蛋白。

1.3.1 参数文件准备 使用AutoGrid 4.0进行能量格点计算，将靶点蛋白（macromolecule）设置为中心坐标（center），使Gird Box网格区域覆盖所研究的靶点蛋白。使用AutoDock 4.0搜索网格范围内对接区域，采用拉马克遗传算法（Lamarckian GA 4.2）进行区域搜索，初始种群数设置为150，能量评定最大次数为2 500 000，每个小分子配体都设定得到20个构象，其他参数选择默认值。

表1 人源受体靶点蛋白信息Tab.1 Information of human receptor target proteins

1.3.2 分子对接计算 采用AutoGrid 4.0计算格点中相关能量，运行AutoDock 4.0进行区域搜索，进行半柔性对接，并对结果进行聚类分析。因篇幅限制，以结合能（binding energy，BE）作为辅助判断，筛选出抑制常数（inhib constant，IC）小于10的靶点蛋白，并将最佳构象导入软件PyMOL，呈现复合物构象，分析观察山核桃叶黄酮单体与NLRP3炎症信号蛋白的结合情况。

2 结果

2.1 山核桃叶黄酮单体的类药性质 经动力学优化后，山核桃叶黄酮单体小豆蔻明、白杨素、松属素、球松素查尔酮和汉黄芩素的类药五性质（相对分子质量、可旋转键数、氢键受体数目、氢键给体数目和脂水分配系数）数据见表2。

2.2 靶点蛋白筛选 半柔性对接后，筛选出IC小于10的靶点蛋白，靶点蛋白与山核桃叶黄酮单体小豆蔻明、白杨素、松属素、球松素查尔酮和汉黄芩素相互作用的BE、IC、氢键组成原子及其键长和键角等相关信息见表3。

2.3 靶标分析 对接结果显示，N-乙酰基转移酶与多种黄酮单体对接较好，可能为黄酮单体治疗痛风性关节炎的共同作用位点，进一步将N-乙酰基转移酶与多种黄酮单体进行对接的终末文件导入PyMOL软 件，分析对接结果的三维结构。见图2。

表2 山核桃叶黄酮单体的类药性质Tab.2 Drug-like properties of flavonoids monomers from Carya cathayensis leaves

表3-1 靶点蛋白与山核桃叶黄酮单体对接结果及相互作用Tab.3-1 Docking interactions between target protein and flavonoids monomers from Carya cathayensis leaves

表3-2 靶点蛋白与山核桃叶黄酮单体对接结果及相互作用Tab.3-2 Docking interactions between target protein and flavonoids monomers from Carya cathayensis leaves

图2 黄酮单体与N-乙酰基转移酶作用Fig.2 Interaction between flavonoids monomers and N-acetyltransferase

3 讨论

大量研究表明，关节腔中析出的尿酸盐结晶可刺激NLRP3中C端的LRR，使N端PYD募集ASC和caspase-1，形成NLRP3炎性体，寡聚化后活化caspase-1，酶解IL-1β前体，释放成熟的IL-1β，从而介导炎症反应的发生[11-12]。正常情况下，NLRP3被HSP90、SGT1抑制，处于静止状态，而尿酸盐沉积后不仅可通过刺激细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH） 氧化酶，使TXNIP脱离TRX，氧化线粒体DNA，以此激活NLRP3炎性体，还能在乙酰化微管蛋白的参与下，刺激单核-巨噬细胞表达NLRP3炎性体。有研究表明，细胞膜表面的P2X7可通过影响细胞钾离子平衡，激活NLRP3炎性体[13-14]。

依据对接结果，本研究提示，山核桃叶黄酮单体可作用于NLRP3炎症通路的多个靶点，且抗痛风性关节炎的作用机制存在差异。按IC排序，依次是小豆蔻明、球松素查尔酮、汉黄芩素、白杨素和松属素。小豆蔻明阻断NLRP3炎性体激活及其信号传递可能与抑制N-乙酰基转移酶-2、TXNIP和caspase-1的活性，以及抑制核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的释放，抑制NLRP3炎性体（LRR）激活、影响花生四烯酸代谢等有关。球松素查尔酮的生物活性可能主要是抑制花生四烯酸代谢，抑制HSP和TRX2的活性，以及抑制pro-caspase-1酶解，同时可能参与调节细胞钾离子浓度失控。汉黄芩素可能阻断NLRP3炎性体（PYD）活化，抑制N-乙酰基转移酶-1活性以及caspase-1前体的酶解，以及阻断IL-1R与配体的结合。白杨素主要抑制N-乙酰基转移酶-2、N-乙酰基转移酶-1、caspase-1和HSP的活性，以及阻断NLRP3炎性体（PYD）的活化。松属素可能抑制NLRP3炎性体（LRR）激活，抑制N-乙酰基转移酶-2、N-乙酰基转移酶-1、TRX2和TXNIP的活性，以及抑制IL-1R与配体结合。

据研究报道，黄酮类中药提取物可降低由尿酸盐沉积引起的痛风小鼠关节肿胀度，并减少滑膜组织NLRP3、ASC、caspase-1等蛋白表达，提示黄酮类中药可抑制NLRP3炎性体轴表达[15-16]，此与本实验分子对接的结果一致。在糖尿病治疗研究中，黄酮类药物还可提高钠-钾-ATP酶活性，向细胞内泵入钾离子，由此调节细胞内的离子浓度[17]，从而缓解由尿酸盐引起的细胞钾离子流失，抑制NLRP3炎性体的激活。N-乙酰基转移酶参与微管蛋白对NLRP3的排列和激活，且有报道证实其与药物性肝伤害及炎症密切相关[18]，本实验分子对接结果显示，其与多种黄酮单体对接较好，提示黄酮通过活性基团羟基和羰基抑制微管蛋白乙酰化，从而阻止其对NLRP3的激活，并缓解药物性肝损伤及炎症反应，与现有报道天然黄酮可治疗化学性肝损伤并能抑制炎症反应一致[19]。

NLRP3炎性体与心血管疾病密不可分，有学者在研究中药黄酮类提取物对动脉粥样硬化的治疗作用时发现，药物中的各黄酮单体之间可能存在协同作用，以此增加抗炎效果[20-21]。也有研究发现山核桃叶黄酮单体能够作用于Toll/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88） 通路，抑制NF-κB释放，减少炎症因子的表达从而可以防治痛风性关节炎[22]。此外，黄酮类药物在治疗缺血再灌注损伤时可抑制一氧化氮合酶活性，从而起到抗氧化作用，其中羟基作为取代基发挥抗氧化活性，不仅可电离出氢原子中和氧自由基，还能抑制花生四烯酸代谢酶及其代谢产物的活性，从而保护机体免受氧化损伤[23-25]。

中药黄酮成分天然、多靶多效，可作为痛风性关节炎治疗药物的研究方向。本研究借助分子对接技术模拟并探讨了山核桃叶黄酮单体成分抗痛风性关节炎的作用机制，发现山核桃叶提取物中5种主要黄酮单体可通过多途径抑制NLRP3炎性体的激活和信号传递，且各单体均与N-乙酰基转移酶结合较好，可作为抗痛风药物研究的新方向。从中药中筛选抗痛风性关节炎的活性单体，研究其作用靶点和机制，是目前研究天然药物防治痛风性关节炎的热点。分子对接技术可构建药效物质-作用靶点关系，发掘中药药效基础及其抗炎机制，为探索治疗痛风性关节炎的活性成分、治疗靶点等提供参考。但本文只在理论上预测了山核桃叶黄酮单体对痛风性关节炎NLRP3炎症信号通路的作用机制，准确度较低，需进一步对预测结果进行实际验证，使研究结论更具科学性。