缺氧条件下人脐带源性间充质干细胞增强缺氧诱导因子-1α表达促进肺腺癌细胞增殖

李昶，赵成岭，陈诗军，陈余清

（蚌埠医学院第一附属医院呼吸与危重症学科，蚌埠233004）

肺癌是目前危及人类生命健康的恶性肿瘤，也是国内外死亡率较高的恶性肿瘤之一[1]。传统的治疗模式包括手术切除、放疗和化疗。目前新崛起的靶向治疗正在发挥其更好的治疗作用。尽管一部分患者的生存率获得了提高，但总体来看，肺癌的中位生存率不尽人意。2017年美国的肺癌5年总生存率为18%[2]， 2016年中国的肺癌5年总生存为率15.6%[3]。因此，寻找一种更有效的治疗途径迫在眉睫。

人脐带源性间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hucMSCs）是多功能基质细胞，因其具有强大的分化能力和免疫调节等特性，已经应用于多种疾病的治疗，如肺纤维化、组织修复、移植物抗宿主疾病等。近年研究显示，hucMSCs具有肿瘤治疗的靶向性，hucMSCs具有特异性归巢于肿瘤部位及其转移灶的能力，同时具有对机体的低免疫源性和逃避宿主免疫监视的能力，这为hucMSCs作为肿瘤治疗药物载体递送治疗剂提供了巨大的希望；多项研究发现，利用hucMSCs作为某些基因、细胞因子及趋化因子等的载体作用于肿瘤的治疗，能够明显的促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖及侵袭能力，但在肺癌方面研究甚少[4-6]。前期的研究显示，在小鼠体内，hucMSCs在与肺腺癌A549细胞株共培养时，能促进A549细胞生长，部分细胞还发生了恶性转化，但在体外培养中这一发现甚少[7]。

更值得一提的是，肿瘤微环境中缺氧是最明显的特征之一[8]，对于肿瘤血管生成、转移和多重耐药性是必不可少的，肿瘤内部的缺氧无血管区域显著阻碍了治疗剂的输送[9]。低氧张力导致对当前应用的抗癌疗法的抗性包括放射疗法、化学疗法和光动力疗法效果不佳，其效力与肿瘤氧供应水平紧密相关[8]。

缺氧诱导因子 -1α （hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）属碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族成员，在人类多种肿瘤中高表达[10]，且与肿瘤的不良预后、恶性进程存在明显正相关，与治疗敏感性、患者生存率存在负相关[7,11-14]。生存素(survivin)是一种癌基因[14]，是凋亡蛋白家族抑制剂中最小的成员，在大多数人类癌症中高表达，包括肺癌、胰腺癌、宫颈癌和乳腺癌等[15,16]，与肿瘤细胞增殖、进展、血管生成、治疗抗性和不良预后等相关。李[17]等发现，hucMSCs与肺腺癌A549细胞在体内外共培养的结果不同，而缺氧是实体肿瘤微环境的主要变化。为了探究缺氧是否是造成hucMSCs促进肺腺癌A549细胞增殖的原因，也为了避免造成错误的治疗效果，本研究通过建立缺氧条件下hucMSCs与肺腺癌A549细胞非接触共培养模型，从HIF-1α和survivin途径探讨缺氧条件下hucMSCs促进A549细胞增殖的可能机制。

材料和方法

1 细胞、主要试剂和仪器

肺腺癌A549细胞株受赠于蚌埠医学院第一附属医院呼吸科实验室；YBR®Premix Ex Taq、Prime-Script™RT reagent Kit with gDNA Eraser 以及 RNAi Plus 购于日本takara公司；氯仿、异丙醇以及乙醇购于美国阿拉丁（Aladdin）公司；DMEM/High、双抗、胰酶购于美国Hyclone公司；胎牛血清购于以色列BI公司；PBS购于南京生兴生物技术有限公司；DMSO购于美国Sigma公司；血球计数板购于上海求精生化试剂仪器有限公司；MTT试剂盒购于Biosharp公司；转染试剂lipofectamine3000（invitrogen,L3000015）购于赛因百奥生物技术公司；三气培养箱购于Thermo fisher公司。

2 人脐带源性间充质干细胞的体外培养和鉴定

新鲜脐带取自蚌埠医学院第一附属医院妇产科。在经过产妇和家属同意之后，取自于手术室。无菌保温条件下运送。在超净台中将脐带放入含1%双抗的PBS 中充分洗净血渍，剪碎至1～2mm3的小块，放置于25cm2的培养瓶中铺满约60%，再将其倒扣4h蒸发水分。然后加入2～3ml 含有10%FBS 的DMEM/High 完全培养基，置于37℃、5%二氧化碳及饱和湿度的培养箱中培养。3d后更换培养液，然后每隔3～4d换液。当细胞长满瓶底80%左右时，用PBS 洗涤2次，0.25%胰酶消化、回收细胞，并按1:2的比例传代。

取第3～5代为对数生长的hucMSCs为后续实验所用。可见细胞形成集落，细胞形态均一，呈旋涡状生长，细胞体积较原代细胞偏大、胞质丰富，具有典型hucMSCs的形态特点。流式细胞技术分析，显示表达hucMSCs相关表面标记CD73、CD90、CD105，而不表达单核细胞表面标记CD14、造血干细胞表面标记CD34、人类白细胞共同抗原CD45。

3 肺腺癌A549细胞培养

于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中培养A549细胞，置于37℃、5%二氧化碳及饱和湿度的培养箱中，每2d传代一次，取对数生长期的细胞用于后续实验。常氧条件为细胞培养在普通培养箱中，氧气浓度为20%左右，缺氧条件是细胞培养在三气培养箱中，氧气浓度为1%。

4 实验分组

根据培养箱氧气浓度的不同和A549细胞中的HIF-1α是否被沉默，将实验分为以下6组：①Nor组（无共培养的A549细胞，常氧条件）；②hucMSCs Nor组（与hucMSCs共培养的A549细胞，常氧条件）；③Hyp组（无共培养的A549细胞，缺氧条件）；④hucMSCs Hyp组（与hucMSCs 共培养的A549细胞，缺氧条件）；⑤si-HIF-1α Hyp组（无共培养的沉默HIF-1α的A549细胞，缺氧条件）；⑥si-HIF-1α+hucMSCs Hyp组（与hucMSCs共培养的沉默HIF-1α的A549细胞，缺氧条件）。

5 RNA干扰

委托南京东极生物公司对各实验组A549细胞的HIF-1α基因进行RNA干扰。HIF-1α基因干扰序列为： GGGCGTCTTATTGTCGTTATT，转染效率为71%。

6 RT-PCR检测

培养细胞去除培养基，加PBS洗一次，除PBS，加入1ml TRIzol，室温放置2min，将TRIzol转移至无RNA酶的EP管中。 按常规方法提取RNA后，加入50μl DEPC水溶解，Nanodrop检测浓度，-80℃冰箱保存。应用Takara逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA。以cDNA产物为模版，配置10μl体系进行PCR扩增，检测survivin表达情况。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃45s，58℃30s，72℃1 min35个循环，最后72℃延伸10min。survivin引物为：上游引物 5’-CCACCGCATCTCTACATTCA-3’;下游引物 5’-CCAAGTCTGGCTCGTTCTC-3’，产物大小为116bp。内参基因GAPDH引物序列为：上游引物5’-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAA-3’，下游引物5’-GGGTGGAATCATATTGGAACATGT-3’，产物大小为101bp。HIF-1α引物为：上游引物5’-CAGATCTCGGCGAAGTAAAGAA-3’，下游引物5’-GATGGTAAGCCTCATCACAGAG-3’，产物大小为115bp。配置好反应液后，在PCR机中操作，95℃预变性2min，95℃ 15s，72℃（视不同的基因而定）1min退火40个循环，最后72℃延伸10min。

数据分析：计算每组ΔCt并使用ΔΔCt=实验组ΔCt -对照组ΔCt，最后，使用公式n =2ΔΔCt计算待测基因的相对表达水平。

7 MTT法检测细胞增殖

收集对数生长期的A549细胞接种于96孔板中，每孔细胞数3×103个,体积为100μl，继续培养24h后进行分组及细胞内转染，每组6个复孔。分别于转染后12、24、48、72h时终止培养，每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，继续培育4h，弃上清，每孔加人DMSO 100μl，振荡10min，使结晶充分溶解，在全自动酶标仪上测各孔570nm波长处的吸光度。

8 Western blot

细胞转染后48h，常规提取A549细胞总蛋白。使用二喹啉甲酸（BCA)法蛋白定量法检测总蛋白浓度。取等量的各组细胞总蛋白(50μg)应用5%聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）进行蛋白电泳分离，随后转印至硝酸纤维膜（PVDF）上，5%脱脂奶封闭1h，用TBS洗膜，加入兔抗人survivin单克隆抗体（稀释浓度1:200）、兔抗人HIF-1α单克隆抗体（稀释浓度1:200）和兔抗人GADPH单克隆抗体（稀释浓度1:500）4℃过夜。TBS洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（稀释浓度1:2000），室温孵育1h。最后加入ECL显示液，反应3min，入暗室曝光45s，显影定影后Tanon5200化学发光检测系统（Tanon）扫描分析。结果采用Quantity One®software version 4.6.2图像分析软件进行光密度分析，各组蛋白条带光密度值均以对应的内参照GADPH为基准进行校正，计算相对光密度值。

9 细胞划痕实验

将生长融合到培养皿80%～90%的细胞用胰酶消化下来，1000r/min离心，去上清，加入完全培养基重悬细胞，将细胞分别种在6孔板中，每孔种5×106个细胞。待细胞长满后，去除培养基，用PBS洗一次细胞，用200μl吸头在六孔板中划一道直线，用PBS洗两次，去除脱落的细胞，用PBS洗2次，将残余的细胞洗干净，在显微镜下拍照，加入培养基常规培养（或缺氧培养）12h，24h后分别拍照。

10 统计学分析

采用SPSS22.0统计软件进行统计学分析。Survivin及HIF-1α基因的mRNA和蛋白相对表达水平¯x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 缺氧和缺氧hucMSCs共培养促进A549细胞增殖

MTT实验显示，在常氧培养时，hucMSCs共培养能明显抑制A549细胞的增殖；在缺氧培养条件下，A549细胞的增殖明显增强，hucMSCs共培养明显促进缺氧对A549细胞增殖的增强作用，干扰沉默HIF-1α基因显著抑制缺氧和hucMSCs共培养对A549细胞增殖的促进作用（表1）。

表1 缺氧和hucMSCs共培养对A549细胞增殖影响的统计学分析Tab. 1 Statistical analysis for effect of hypoxia and co-cultured with hucMSCs on proliferation of A549 cells

2 缺氧和缺氧hucMSCs共培养促进A549细胞迁移

划痕实验显示，在常氧培养时，hucMSCs共培养能明显抑制A549细胞的迁移；在缺氧培养条件下，A549细胞的迁移明显增强，hucMSCs共培养明显促进缺氧对A549细胞迁移的增强作用，干扰沉默HIF-1α基因显著抑制缺氧和hucMSCs共培养对A549细胞迁移的促进作用（图1、表2）。

表2 缺氧和hucMSC共培养对A549细胞迁移影响的统计学分析Tab. 2 Statistical analysis for effect of hypoxia and co-cultured with hucMSCs on migration of A549 cells

图1 缺氧和hucMSC共培养对A549细胞迁移影响的划痕实验检测Fig. 1 Scratch assay for effect of hypoxia and co-cultured with hucMSCs on migration of A549 cells

3 沉默HIF-1α抑制缺氧和缺氧hucMSCs共培养对A549细胞HIF-1α和survivin表达的上调

Real time PCR和Western blot检测显示，常氧条件下，hucMSCs共培养对A549细胞内HIF-1α和survivin mRNA表达无明显影响，但显著下调HIF-1α和survivin蛋白水平表达；缺氧条件下，A549细胞HIF-1α和survivin表达明显增加，hucMSC共培养对HIF-1α和survivin mRNA表达的影响与单纯缺氧无明显差异，但对HIF-1α和survivin蛋白表达的上调更为明显，沉默HIF-1α显著抑制这种对HIF-1α和survivin表达的增加作用（图2-图6）。

讨 论

HIF-1α基因定位于人类第14号染色体q21～24区，编码的HIF-1α蛋白。Survivin是取自人类基因库杂交筛选分离出的一种癌基因。本研究室前期研究发现，survivin在肺腺癌的增殖转移侵袭抗凋亡过程中都有作用，且在肺腺癌中高表达，在正常组织及癌旁组织中低表达或不表达；在缺氧条件下，HIF-1α通过调控survivin从而抑制细胞凋亡，促进增殖[18]。研究表明，缺氧条件下，癌细胞可通过多种途径刺激新生血管，增加氧供给，允许癌细胞在缺氧状态下生存，或者通过刺激癌细胞的代谢通路减少氧摄取[9]，通过趋化作用进入肿瘤微环境中的hucMSCs也会出现代谢应激状态[19]。

图2 缺氧和hucMSC共培养对A549细胞HIF-1α mRNA表达影响的实时定量PCR检测。**P＜0.01; n=18Fig.2 Quantitative real-time PCR detection for effect of hypoxia and co-cultured with hucMSCs on expression of HIF-1α mRNA. **P＜0.01;n=18

图3 缺氧和hucMSC共培养对A549细胞 survivin mRNA表达影响的实时定量PCR检测。**P＜0.01；n=18Fig.3 Quantitative real-time PCR detection for effect of hypoxia and co-cultured with hucMSCs on expression of survivin mRNA in the A549 cells. **P＜0.01; n=18

图4 缺氧和hucMSC共培养对A549细胞 HIF-1α 和survivin表达影响的Western blot检测Fig. 4 Western blot detection for effect of hypoxia and co-cultured with hucMSCs on expression of HIF-1α and survivin protein in the A549 cells

图5 缺氧和hucMSCs共培养对A549细胞HIF-1α表达影响的统计学分析。**P＜0.01；n=18Fig. 5 Statistical analysis for effect of hypoxia and co-cultured with hucMSCs on expression of HIF-1α protein in the A549 cells. **P＜0.01;n=18

图6 缺氧和hucMSC共培养对A549细胞survivin表达影响的统计学分析。**P＜0.01；n=18Fig. 6 Statistical analysis for effect of hypoxia and co-cultured with hucMSCs on expression of survivin protein in the A549 cells. **P＜0.01;n=18

本研究前期实验发现，常氧状态下的hucMSCs对A549细胞的增殖具有抑制作用；而在缺氧状态下，hucMSCs对A549细胞的增殖起促进作用[7]。为了进一步明确在缺氧状态下hucMSCs如何影响A549细胞的增殖，本实验观察了低氧条件下hucMSCs对A549细胞增殖和HIF-1α、survivin表达的影响，并设计了si-HIF-1α来探讨hucMSCs对A549细胞的增殖和HIF-1α、survivin表达的影响，结果显示，与常氧条件下相比，缺氧条件下hucMSCs促进A549细胞的survivin和HIF-1α表达，但survivin和HIF-1α mRNA表达升高无统计学差异，提示缺氧条件下可能尚有其他未知通路也能在蛋白水平上调survivin和HIF-1α和促进A549细胞增殖。干扰HIF-1α后，缺氧条件下的hucMSCs共培养对A549细胞HIF-1α和survivin mRNA和蛋白表达的上调被抑制，提示在缺氧条件下，hucMSCSs通过促进A549细胞的survivin和HIF-1α的表达，一方面survivin可以促进A549细胞增殖，另一方面HIF-1α又可以继续作用于下游的survivin，促进survivin的表达，在双重促进的机制作用下，在缺氧条件下hucMSCs使A549细胞增殖能力进一步增强。

综上，在缺氧条件下hucMSCs能上调A549细胞的HIF-1α和survivin表达而使肺腺癌A549细胞呈持续增殖，但其机制有待进一步研究。缺氧状态下，HIF-1α的下游可能还存在除了survivin以外的其他下游靶点实现对细胞增殖的调控，抑或是在缺氧状态下hucMSCs可激活其他的信号通路实现对A549细胞增殖的促进作用。