海洋光合细菌筛选及其对养殖水体修复效果的测定

王光玉,韩亚萌,冯亚丽,陈 雷

(哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院，山东 威海 264209)

随着海洋水产养殖业的迅猛发展，在高投入、高产出的模式下，养殖密度超过了水体容量，大量的残饵、生物代谢产物沉积于池底，池底成为水产养殖过程中最容易出现问题的部位。底泥是营养物质的重要蓄积库，成为水体营养物质的内负荷[1]，沉积在池底的营养物质会持续释放到上层水体中，导致藻类繁殖，水体水质恶化[2]。对于生活在水体中下部或底栖生物如刺参、虾、鲍鱼，底质环境条件更为严峻，在某些极端环境条件下，底质恶化导致养殖效益下滑的现状越来越普遍和显著。

光合细菌(Photosynthetic Bacteria，PSB)具有多种代谢方式，根据光的可用性以及氧气和合适的碳源等条件，以光能自养或异养方式生长，在黑暗条件下可以消耗有机物质，有些也可以利用硫化氢[3-4]，能够利用水中过剩的有机物质作为自身生长繁殖的营养源，迅速分解水中的氨态氮、硫化物等有害物质，有效降低养殖水体中的化学耗氧量(COD)、生化耗氧量(BOD)等污染指标，提高水体的pH，不消耗额外的氧气。对减少底栖生物的环境胁迫具有重要的改善作用，可以避免极端环境下的养殖灾害。

通过富集、分离海洋光合细菌，筛选优势菌株，并研究高温下对养殖底泥中氨氮、亚硝酸盐、硫化物、COD的降解能力，以期在水产养殖底质改良中发挥作用。

1 材料与方法

1.1 材料

富集培养基：KH2PO4，1.0 g；NaHCO3，3.0 g；乙酸钠，2.0 g；NH4Cl，1.0 g；微量元素溶液，1.0 mL；酵母膏，0.5 g；蛋白胨，0.5 g；陈海水，1.0 L，pH 7～8，120 ℃灭菌20 min；NaHCO3，溶液过滤除菌后加入灭菌的培养基中。

分离培养基：NH4Cl，1.0 g；MgCl2，0.2 g；酵母膏，2.0 g；K2HPO4，1.0 g；乙酸钠，2.0 g；琼脂，20 g；NaHCO3，2 g；酒，2 mL；海水，1 000 mL，pH 7.0～8.0，120 ℃灭菌20 min；NaHCO3溶液，酒精过滤除菌后加入灭菌的培养基。

仪器和试剂：超净工作台、光照培养箱、梯度PCR仪、电泳仪和电泳槽凝胶成像系统、分光光度计、细菌基因组DNA快速抽提试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 海洋光合细菌的富集、纯化

取2 g山东威海海域金海滩排污口附近污泥加入20 mL的细胞培养瓶中，加入高压灭菌的富集培养基，在光照、微好氧条件下，28 ℃进行富集培养，7 d后弃去培养基，添加新的富集培养基，连续富集3周。采用双层平板法对附着在瓶壁苔和液体的菌液进行分离，将平板置于2 000 Lx、28 ℃条件下培养10～12 d，待平板长出红色菌落后挑取单菌落，连续多次平板划线，分离出纯种，观察光合细菌的形态。

1.2.2 16S rDNA序列测定

挑取单菌落接入装有液体培养基的试管中，隔绝空气，2 000 Lx、28 ℃条件下静置培养。待菌体生长到对数期，利用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒，提取其基因组进行PCR扩增。PCR产物送至上海生工生物工程有限公司测定序列，测序结果提交到NCBI 数据库进行相似性比对。采用MEGA5.0的邻接法进行系统发育树的构建，并与Bootstrap对进化树进行1 000次可信度分析。

1.2.3 光合细菌对底泥的改良试验

(1)

式中：w为降解速率；c0和c分别为初始和取样时各指标质量浓度，mg/L。

2 结果与分析

2.1 光合细菌的富集

污泥来源的光合细菌富集过程中，富集液中菌体生长情况如图1所示。从图中可以看出，富集1周后，培养瓶中富集液开始呈现出红色；富集2周后菌液呈现加深，瓶壁有菌体附着，有红色的菌落沉积在培养瓶底部；富集3周后，富集液中菌体颜色再次加深，变为红棕色，培养瓶底部红色沉淀增多，瓶壁有时绿色菌体附着。

图1 光合细菌富集过程菌体生长情况

富集培养基中含有大量的有机物，进行密闭光照培养可满足光合细菌的生长代谢，尤其可以满足以红螺菌为目标培养物的菌株。培养中发现光合细菌的贴壁生长现象极为明显，极易吸附在其他物体的表面，从颜色、细菌质量浓度和处理表观，光合细菌富集效果明显。

VOCs的净化处理工艺可以分为回收和破坏两大类，其中：回收净化工艺主要包括吸收法、吸附法、膜分离法、冷凝法等，一般是通过物理方法，如改变温度、压力或采用选择性吸附剂和选择性渗透膜等，来富集分离VOCs；破坏工艺则主要包括燃烧法、生物分离法以及等离子气体法等，主要通过化学或生化反应，用热、微生物和催化剂等将VOCs转变成为CO2和H2O等无毒害的无机小分子化合物。

2.2 光合细菌的分离纯化

取富集的光合细菌富集液稀释涂布后观察平板上菌落的形态，挑取单菌落进行革兰氏染色，观察显微镜下菌体形态。试验共获得5株光合细菌，菌落的形态及菌体的形态见表1。

表1 5株光合细菌的形态

2.3 菌株16S rDNA序列测定及系统发育树构建

5株光合细菌的16S rDNA片段经PCR扩增后片段大小约为1500 bp，PCR产物为目标条带。PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，将获得的菌株的16S rDNA序列，运用Blast序列比对程序，与NCBI数据库中的序列进行比对。根据测得的16S rDNA序列，采用MEGA5.0的邻接法(NJ)进行系统发育树的构建，并用Bootstrap对进化树进行1 000次可信度分析(图2和图3)。

如图2所示，PSB1与RhodopseudomonaspalustrisPSB07-19在同一分支上，序列比对结果显示与其相似性达到100%；PSB4与RhodopseudomonaspalustrisstrainATCC 17001在同一分支上，序列比对结果显示与其相似性达到100%，因此将菌株PSB1、PSB4归于红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)。如图3所示，PSB2、PSB3与Rhodovulumsteppensestrain A-20s在同一分支上，相似度高达100%，亲缘关系较近；PSB5与Rhodobactersphaeroidesstrain 2.4.1在同一分支上，序列比对结果相似性为100%。因此将菌株PSB2、PSB3归于小红卵菌属(Rhodovulum)，将PSB5归于红杆菌属(Rhodobacter)。

图2 基于16S rDNA NJ法构建PSB1和PSB4系统发育树

图3 基于16S rDNA NJ法构建PSB2、PSB3和PSB5系统发育树

2.4 光合细菌对底泥水体pH的影响

向污泥中分别添加0.1%、0.5%、1%的PSB1、PSB2，水体pH变化如图4所示。当试验时间超过6 d，向污泥中添加PSB时，光合细菌可以稳定水体pH，保持水体理化性质的稳定，对水体pH缓冲效果随着光合细菌接种量的增加而更加明显。与对照组相比，水体pH一般可以升高0.3～0.5。不做任何处理的对照组，pH出现急剧降低，这可能与高温下水体中溶氧的质量浓度降低、厌氧微生物代谢活动增强导致的酸碱度降低有关，光合细菌转化硫化氢也可能是原因之一。

2.5 光合细菌对底泥水体CODMn的影响

分别用0%，0.1%，0.5%，1%的PSB1、PSB2处理污泥，每2 d测定一次，其CODMn质量浓度随着处理时间的延长而逐渐降低(图5)。经过10 d处理后，PSB1对照组和实验组的CODMn去除率分别为78.26%，89.16%，86.21%，92.91%，PSB2对照组和实验组的CODMn去除率分别为66.67%，73.54%，82.27%，81.23%。与对照组相比，添加光合细菌实验组的CODMn去除率增加，当添加量为1%时，去除率达到最高；对于消除底部的CODMn，PSB1优于PSB2。

图4 PSB1(a)和PSB2(b)处理的底泥水体pH变化情况

图5 PSB1(a)和PSB2(b)处理底泥水体CODMn质量浓度变化

2.6 光合细菌对底泥水体硫化物的影响

用不同含量的PSB1、PSB2处理污泥，其硫化物含量逐渐降低(图6)。PSB1处理10 d后，硫化物去除率分别为54.74%，69.12%，73.49%，79.61%。随着接种量的增加，硫化物去除率相应增加。PSB2处理10 d后，硫化物去除率分别为66.16%，69.91%，64.73%，50.67%。PSB1去除硫化物比PSB2更为稳定，但PSB2在低质量浓度(0.1%)就可以起到较好的作用，具有较好的应用前景。

2.7 光合细菌对底泥水体氨氮的影响

添加光合细菌可有效降低污泥氨氮含量(图7)。PSB1处理10 d后，氨氮去除率分别为83.80%，94.90%，96.91%，97.00%；PSB2处理10 d后，去除率分别为93.89%，95.42%，92.89%，84.52%。对于氨氮的转化去除效果，PSB1优于PSB2，并表现稳定；PSB2对氨氮去除效果较差，但在低质量浓度时效果较好，这可能与菌株的特性有关。

图6 PSB1(a)和PSB2(b)处理底泥水体硫化物质量浓度变化

图7 PSB1(a)和PSB2(b)处理底泥水体氨氮质量浓度变化

2.8 光合细菌对底泥水体的影响

3 讨论

3.1 光合细菌对pH的影响

试验结果显示，光合细菌可以稳定水体pH，且随着添加量的增加，稳定pH的效果越明显。在成分复杂的底泥中，pH受很多因素影响。如：温度升高或浮游生物数量增多会导致pH升高；厌氧微生物代谢活动增强、有机质大量分解时pH则会下降。光合细菌具有多种营养方式，在有机物充足的条件下，可以迅速降解 H2S等酸性物质，起到稳定水体pH的作用[5-6]。张伟珠等[7]研究光合细菌对斑点叉尾鱼苗培育水体水质因子的调控作用，结果表明，施加光合细菌可以维持水体pH的稳定。

图8 PSB1(a)和PSB2(b)处理底泥水体质量浓度

3.2 光合细菌对COD的影响

在本试验中，光合细菌表现出很好的COD降解能力，底泥中CODMn降解率随着添加比例的提高而增大。CODMn降解率达到最大的条件为添加了1%的PSB1，降解率为92.91%。COD是环境水质标准的重要监测指标之一，其大小基本反映了水体受到的有机污染情况。在环境修复、污水处理等方面，光合细菌具有很大的潜力，被应用于各类污水处理行业。王有志等[8]对光合细菌处理中药浸出液废水的效果进行实验研究，结果表明，废水在经过水解酸化预处理后，在光合细菌处理系统内COD平均去除率达到90.7%。谢红刚等[9]采用光合细菌处理啤酒废水，结果表明，最佳菌液投加量为30 mL/L，COD去除率最高可达到80%。光合细菌在水产养殖业方面也被广泛应用。王冰等[10]探讨了光合细菌对模拟海水养殖污水中COD的去除能力，结果显示每100 mL污水投加200 mL光合细菌时COD 去除效果较好，可达到79.2%。易力等[11]利用固定化光合细菌对养殖水体进行生物修复实验，结果表明，接种光合细菌后12 d，pH上升到8.8，养殖水体的COD值和氨氮值分别降低54.29%和80%。

3.3 光合细菌对硫化物的影响

作为较常用的氧化硫化物的微生物之一，光合细菌能以硫化物或硫代硫酸盐作为电子供体，依靠体内特殊的光合色素，从光中获得能量进行光合作用[12]。王梦亮等[13]研究表明，将沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)和类球红细菌(Rhodopseudomonassphaeroides)1∶1混合可有效降低鲤鱼养殖池中硫化物质量浓度，与对照组相比下降77.4%。袁盈波等[14]从宁海东坝养殖场底泥中分离获得一株能以S、Na2S2O3和Na2S等多种含硫化合物作为无机电子供体的光合细菌，研究显示，该菌株处理高质量浓度硫化物的效果较为明显，对畜禽废水和鱼粉废水中硫化物去除率可分别达到68.55%和56.15%。本研究中，在投加了1%的PSB1之后，水体中硫化物的去除率达到79.61%，去除效果明显。值得注意的是，在低投加量情况下，相较于PSB1，PSB2有着更好的去除效果，这可能与菌体结构和生长环境有关。

3.4 光合细菌对氨氮的影响

在本试验中，添加1%的PSB1可以达到最大的氨氮去除率(97%)。氮源是光合细菌生长的必要条件，所有的光合细菌能直接利用的氮源为铵盐，有机氮可以经过氨化作用转化为氨氮，从而被光合细菌所利用。杨绍斌[15]用不同质量浓度的光合细菌菌液处理鲤鱼养殖水，结果表明，光合细菌混合液对鱼塘水的氨氮去除效果明显，去除率最高为88.89%。董艳珍等[16]对1株从养殖池塘底泥中分离获得的光合细菌进行研究，结果表明，1株光合细菌以使生活污水和养殖池塘肥水中的氨态氮分别降低66.6%和74.8%。黄雪娇等[17]从云南某一沼泽地中分离筛选出1株可降解氨氮的光合细菌，试验结果表明，其为Rhodopseudomonas属的一个新菌，投加0.4%的菌剂对模拟废水中氨氮的去除率达99%以上。以上试验结果均表明光合细菌对于氨氮有着很好的降解性能。

3.5 光合细菌对的影响

4 结论

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