基于金纳米花标记的免疫层析法检测牛奶中黄曲霉毒素M1

金玉，刘仁荣，裘雪梅

（江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌330013）

黄曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）是由哺乳类动物摄入被黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）污染的粮食或饲料后在动物体内的代谢产物，具有剧毒性和强致癌性[1]，2002年世界卫生组织国际癌症研究机构将AFM1列为一类致癌物[2]。国内外对AFM1在牛奶及其制品中设定了比较严格的限量标准，欧盟规定鲜奶、高温消毒奶及奶制品中AFM1的含量不能超过0.05 μg/kg，对于婴幼儿配方食品中AFM1限量标准为0.025 μg/kg。我国对牛奶和婴幼儿奶粉中AFM1的限量标准为0.5 μg/kg[3]。AFM1主要存在于国民饮食不可缺少的牛奶及其制品中[4]。所以对牛奶中AFM1含量的检测非常必要。目前用于检测AFM1的薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）[5-6]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]和酶联免疫法吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[9]等方法需要繁琐的操作步骤和较长检测时间才能得到检测结果；胶体金或称球形纳米金（gold nanospherical，AuNSs）免疫层析检测卡虽有快速简便易携带等优点，但因为AFM1的限量标准非常严格，30 nm 左右的AuNSs 因其光学亮度的不足很难提高目标物的检测灵敏度[10]，难以满足检测AFM1灵敏度要求[11-12]。金纳米花（gold nanoflowers，AuNFs）相比于常用的球形纳米金因其分支状凸出于球体表面形成很强的电场效应而表现出更强的光学消光系数[13-15]，且还有着更高的比表面积和复杂的三维立体结构。因其分支结构的特征可以使标记过程中减少空间位阻，从而使目标蛋白更容易在AuNF 表面上固定[16]。目前已有文献报道使用AuNFs 作为探针提高了目标物的检测灵敏度[17-18]。本研究尝试使用AuNFs 标记AFM1单克隆抗体，研制了免疫层析检测卡，其检测灵敏达到12.3 pg/mL，检测范围为20 pg/mL～1 000 pg/mL，比球形纳米金标记的AFM1单抗制备的免疫层析检测卡检测限提高4.3 倍。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

二水合柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）、三水合四氯金酸（HAuCl4·3H2O）、抗坏血酸钠（C6H7NaO6）、牛血清白蛋白（BSA）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）20000、对苯二酚（C6H6O2）：sigma 公司；黄曲霉毒素 M1抗原、黄曲霉毒素M1单克隆抗体：江西科技师范大学生命科学学院分子生物学实验室I 制备；硝酸纤维素膜HF135：美国Millipore 公司；样品垫、结合物垫、吸水纸、底板：上海金标生物科技有限公司；AFM1-ELISA：青岛普瑞邦生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

电热磁力搅拌器（GS7）：德国IKA 公司；紫外可见光分光光度计：Perkinelmer 公司；Multiskan MK3 酶标仪、透射电子显微镜（FEI）：美国 Thermo 公司；高速冷冻离心机（5804R）：德国 Eppendorf 公司生产；XYZ-3D喷金划膜仪HM3035、微自动斩切机（ZQ2000）：上海金标生物科技有限公司；Zeta Plus 粒度电位测试仪：美国BROOKHAVEN INSTUMENTS CORPORATON；纳米金免疫分析读数仪（GM60）：深圳科创志达有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液配置

1%柠檬酸三钠溶液：称取二水合柠檬酸三钠0.5 g于烧杯中，加入50mL超纯水中充分溶解；1%四氯金酸：称取三水合四氯金酸1 g 于烧杯中，加入100 mL超纯水充分溶解；1 mol/L 抗坏血酸钠水溶液：称取抗坏血酸钠1.98 g 于烧杯中，加入10mL超纯水充分溶解；0.03 mol/L 对苯二酚水溶液：称取对苯二酚0.33 g于烧杯中，加入100mL超纯水充分溶解。将4 种溶液过 0.22 μm 滤膜后备用。

1.3.2 AuNSs 和 AuNFs 的制备

AuNSs：取200mL超纯水倒入装有搅拌子的洁净三角烧瓶中，在搅拌状态下加热至沸腾，加入1mL1%柠檬酸三钠和200 μL 1 mol/L 抗坏血酸钠，待溶液再次沸腾后，一次性准确加入2mL的1%四氯金酸溶液，溶液在1 min 内慢慢转变为深酒红色，稳定后开始计时10 min，结束后搅拌冷却至室温。然后将冷却的AuNSs 溶液过0.22 μm 滤膜，置于室温，洁净处备用。

AuNFs：在室温搅拌条件下，取100mL超纯水倒入装有搅拌子的洁净三角烧瓶中，调节溶液pH 值为7.0±0.1，分别加入0.5mL1%四氯金酸水溶液、0.5mLAuNSs 和440 μL 1%柠檬酸三钠水溶液，最后在三角瓶中加入1mL0.03 mol/L 的对苯二酚水溶液，室温条件下反应30 min，结束后搅拌冷却至室温。然后将冷却的AuNFs 溶液过0.22 μm 滤膜，置于室温，洁净处备用。

1.3.3 金纳米花 AFM1抗体（AuNF-AFM1-Mab）和的球形纳米金AFM1抗体（AuNS-AFM1-Mab）标记物的制备

AuNF-AFM1-Mab 的制备：取10mLAuNFs 于含有搅拌子的洁净烧杯内，加入40 μL 0.2 mol/L K2CO3调节溶液pH 值，然后缓慢加入终浓度为4 μg/mL 的AFM1抗体。室温搅拌反应30 min 后加入1mL5 %PEG20000 封闭30 min。反应结束后将标记溶液于离心机内1 000 r/min，离心5 min，然后取上清液在10 000 r/min 条件下离心20 min，下层沉淀用1mL重悬液（5%海藻糖，0.5%BSA，0.5%甘氨酸，0.5%T-20 溶于10 mmol/L PBS）溶解。放置于2 ℃～8 ℃保存备用。

AuNS-AFM1-Mab 的制备：取 10mLAuNSs 于含有搅拌子的洁净烧杯内，加入100 μL 0.2 mol/L K2CO3调节溶液pH 值，然后缓慢加入终浓度为4 μg/mL 的AFM1抗体，室温搅拌反应30 min。然后加入1mL10%BSA 封闭30 min。结束后将标记溶液置于离心机内900 g，离心5 min，然后取上清液在8 000 g 条件下离心30 min，下层沉淀用1mL重悬液溶解。放置于2 ℃～8 ℃保存备用。

1.3.4 AFM1金纳米花免疫层析检测卡（AFM1-gold nanoflower immunochromatographic test card，AFM1-GFICT）和球形纳米金免疫层析检测卡（AFM1-gold nanospherical immunochromatographic test card，AFM1-GICT）的制备

将 AFM1-BSA（0.5 mg/mL）和山羊抗鼠（0.3 mg/mL）分别划在NC 膜的T 和C 线位置。在预处理的结合物垫（5%蔗糖、0.5%T-20、溶于 2 mmol/L 硼酸缓冲液）上各喷AuNS-AFM1-Mab 和AuNF-AFM1-Mab 标记物的量为2 μL/cm。将玻璃纤维切割成300 mm×18 mm大小，用样品垫预处理液（0.5%Tetronic1307、0.5%BSA 溶于 20 mmol/L PBS，pH 值 7.5±0.1） 将玻璃纤维浸透10 min。将上述制备好的组分置于37 ℃，相对湿度小于或等于35%的恒温箱内干燥备用。将结合物垫、样品垫和NC 膜组装成大板[19]。把大板切成65 mm×3.95 mm 的测试条装入WE-2 塑料卡内组装成检测卡。

1.3.5 AFM1-GFICT 和AFM1-GICT 标准曲线的建立

在相同AFM1抗原和AFM1抗体用量条件下制备AFM1-GFICT 和AFM1-GICT。测量不含AFM1的空白牛奶（筛选过程参考GB 5009.24-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M 族的测定》[20]，以下空白牛奶均为此样品）中加入AFM1标准品为下列浓度（0、10、20、50、100、200、300、500、900、1 000、2 700、5 400 pg/mL）的样品，用纳米金免疫分析读数仪读取上述12 个样品的信号值。以加标AFM1样品浓度为X 轴，测量信号值为Y 轴绘制非线性四参数拟合曲线。根据拟合方程式求出每个信号值对应AFM1的浓度，将AFM1标称浓度和反求浓度做直线拟合，当直线拟合系数R2大于0.99时说明此系列加标AFM1样品浓度的非线性四参数拟合曲线用于牛奶样品的测量有较好的准确度。计算AFM1-GFICT 和 AFM1-GICT 的检测限（limit of detection，LOD）定义为：分别用 AFM1-GFICT 和 AFM1-GICT检测不含AFM1的牛奶样品，重复检测20 次，得到20次测量的信号值，计算其平均值（M）和标准差（SD），得出M-2SD 所对应的信号值，根据AFM1-GFICT 和AFM1-GICT 非线性四参数拟合方程，将M-2SD 所对应的信号值代入上述拟合方程求出对应的浓度值，即为其LOD。

1.3.6 AFM1-GFICT 分析性能评估

1.3.6.1 准确度、精密度和稳定性评价

选择空白牛奶样品，分别加入AFM1标准品使其浓度分别为 0.1、0.3、0.5 μg/kg，用室温和 37 ℃放置 30 d的AFM1-GFICT 对3 个水平的加标样品检测，每个浓度重复检测10 次。计算测量平均值和标准差，求出回收率和变异系数。

1.3.6.2 特异性评价

选择AFM1的结构类似物AFB1和其他3 种常见真菌毒素（呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素）来计算AFM1-GFICT 与它们的交叉反应率。

交叉反应率/%=AFM1-EC50/分析物-EC50×100

式中：EC50表示半最大效应浓度，pg/mL。

将AFB1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素分别配置浓度为 0、50、100、200、500、1 000、2 000、5 400 pg/mL，用AFM1-GFICT 对4 种真菌毒素系列浓度检测。

1.3.6.3 实际样品检测

从乐买佳超市购买了5 种不同品牌的纯牛奶、5种不同品牌的生鲜奶和3 种不同品牌的奶粉。从生工生物工程（上海）有限公司购买2 批次的工业脱脂奶粉各1 瓶。上述纯牛奶直接用AFM1-GFICT 进行检测；奶粉检测过程为：称取3 g 奶粉，加入30mL10%甲醇水振荡混匀5 min 后，置于离心机内6 000 r/min，离心5 min，取上清用AFM1-GFICT 进行检测。

2 结果与分析

2.1 AuNFs和AuNSs的表征

AuNFs 和 AuNSs 的 （ultraviolet and visible spectrophotometry，UV）扫描图见图1。

图1 AuNFs 和 AuNSs 的 UV 扫描图Fig.1 UV absorption spectrum of AuNSs and AuNFs

金纳米粒子的形态和粒径决定了其胶体的稳定性，颜色，最大吸收峰，AuNSs 的最大吸收峰528 nm，峰窄而平滑，说明其分散性良好，颗粒均匀；AuNFs 最大吸收峰为735 nm，表明此AuNFs 相对粒径大，分支状数量较多；经过粒度仪测量AuNFs 的有效粒径为（91.8±0.8）nm，AuNSs 的有效粒径为（30.5±0.3）nm。

AuNSs 和AuNFs 的实物图及透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）照片见图2。

图2 AuNFs 和AuNSs 实物照片和AuNFs 透射电镜扫描照片Fig.2 Photographic images of AuNFs and AuNSs and TEM images of AuNFs

图2 AuNSs、AuNFs 实物照片和透射电镜扫描照片Fig.2 AuNSs，AuNFs physical pictures and transmission electron microscope images

AuNFs 和AuNSs 的结构和形态表明，AuNSs 是球形金纳米粒子，而AuNFs 在实心的球形金纳米粒子表面生长出几个到10 几个边缘平滑的分支状凸出，两种颗粒分散性良好。

AuNFs 的Zeta 电位测量结果见图3。

AuNFs 的 Zeta 电位为（-41.6±1.6）mV，理论上Zeta电位绝对值大于30 mV 时粒子有较好的稳定性[21]，将AuNFs 放置于室温存储12 个月，AuNFs 没有发生集聚，说明此AuNFs 有较好的稳定性。数据表明AuNFs和AuNSs 可用于标记单克隆抗体。

图3 AuNFs 的 Zeta 电位Fig.3 Zeta potential of AuNFs

2.2 AuNFs标记AFM1-Mab最佳标记pH值和最合适标记蛋白质浓度

AuNF 标记AFM1抗体的pH 值优化结果见图4。

图4 AuNF 标记AFM1抗体的pH 值优化Fig.4 Optimize the pH of the AuNF-labeled AFM1-Mab

取空白牛奶样品配置AFM1浓度为0.3 ng/mL 的阳性样品，在不同pH 值用AuNFs 标记AFM1-Mab 制备免疫层析检测卡，用于检测空白牛奶和阳性牛奶样品，反应20 min 后用纳米金免疫分析读数仪读取T/C的信号值，定义阳性T/C 信号值除以阴性T/C 信号值为此pH 值下的T 线抗原AFM1-BSA 与AuNF-AFM1-Mab 的结合率，结合率越低说明此时阻断情况越好，灵敏度越高，抗原与抗体的反应更彻底，结合在AuNF 上的抗体活性最好，当在 2mLAuNFs 中加入 8 μL～10 μL 0.2 mol/L K2CO3时，此时阴性信号值与阳性信号值差值较大，结合率较低，说明此时标记在AuNF 上的抗体活性最好，所以此AuNF 标记AFM1的最合适标记pH 值为在 1mLAuNFs 中加入 4 μL～5 μL 的 0.2 mol/L K2CO3。

AuNF 标记AFM1抗体的浓度优化结果见图5。

在优化好的pH 值下，在1mLAuNFs 中加入4 μg/mL AFM1抗体时，此时阴性信号值与阳性信号值差值较大，结合率最低，即为AuNFs 最佳标记蛋白质浓度。

2.3 AFM1-GFICT关键参数优化

AFM1-GFICT 反应体系的pH 值、离子强度和表面活性剂优化结果见图6。

图5 AuNF 标记AFM1抗体的浓度优化Fig.5 Optimize the concentration of AuNF-labeled AFM1-Mab

调节反应体系 pH 值为 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5，分别用AFM1-GFICT 检测用空白牛奶配置的0、0.3 ng/mL 的样品，图中每2 个相连的卡为一组条件的检测结果，显色结果表明：pH 值在7.5～8.0，阴性和阳性显色对比较明显，离子强度为20 mmol/L PBS 阴性和阳性显色对比较明显，表面活0.5%Tetronic-1307条件下阴性和阳性显色对比较明显。

AFM1-GFICT 反应动力学曲线见图7。

AFM1-GFICT 检测空白牛奶样品和用其配置AFM1为0.1ng/mL 的样品，从10 min 开始计时到38 min结束，每分钟测量一次它们的信号值。数据表明，当反应在20 min～25 min 时，其信号值无明显差别，所以选择AFM1-GFICT 最佳读数时间为20 min～25 min。

图6 优化AFM1-GFICT 反应体系的pH 值、离子强度和表面活性剂Fig.6 Optimizes the pH，ionic strength and surfactant of the AFM1-GFICT reaction system

图7 AFM1-GFICT 反应动力学曲线Fig.7 AFM1-GFICT reaction kinetics curves

2.4 AFM1-GFICT和AFM1-GICT定量标准曲线的建立

AFM1-GFICT 检测 AFM1浓度 0～1 000 pg/mL 样品的显色结果和其非线性四参数曲线拟合见图8 和图9。

可以看出从0 到1 000 pg/mL 显色有明显梯度，AFM1-GFICT 在 20 pg/mL～1 000 pg/mL 时反求浓度与标称浓度直线拟合R2=0.999 8，非线性四参数曲线拟合相关系数R2=0.999 3，EC50（半最大效应浓度）=68.5 pg/mL，计算出最低检测限为12.3 pg/mL。

图8 AFM1-GFICT 检测含 AFM1浓度 0～1 000 pg/mL 样品的显色Fig.8 AFM1-GFICT detects AFM1concentration 0～1 000 pg/mL color development result

图9 AFM1-GFICT 非线性四参数曲线拟合Fig.9 AFM1-GFICT nonlinear four-parameter curve fitting

AFM1-GICT 检测 AFM1浓度 0～5 400 pg/mL 样品的显色结果和其非线性四参数曲线拟合见图10 和图11。

图10 AFM1-GICT 检测含AFM1浓度0～5 400 pg/mL 样品的显色结果Fig.10 AFM1-GICT detects AFM1concentration 0～5 400 pg/mL color development result

图11 AFM1-GICT 非线性四参数曲线拟合Fig.11 AFM1-GICT nonlinear four-parameter curve fitting

可以看出从0 到5 400 pg/mL 显色有明显梯度，AFM1-GICT 在 100 pg/mL～5 400 pg/mL 时反求浓度与标称浓度直线拟合R2=0.999 0，非线性四参数曲线拟合相关系数R2=0.999 8，EC50=305.0 pg/mL，计算出最低检测限为53.0 pg/mL。检测结果表明在同样抗原和抗体用量时AFM1-GFICT 的最低检测限比AFM1-FICT高4.3 倍。表明用AuNFs 作为检测信号的放大有利于提高免疫层析检测试剂的灵敏度。

2.5 AFM1-GFICT分析性能评估

2.5.1 AFM1-GFICT 加标回收、精密度和稳定性测试

AFM1-GFICT 准确度、精密度和稳定性检测结果见表1。

数据表明室温放置AFM1-GFICT 的加标回收率在80.4%～118.2%之间，变异系数在4.27%～9.43%，37 ℃放置AFM1-GFICT 的加标回收率在81.5%～113.0%之间，变异系数在8.9%～11.9%，表明AFM1-GFICT 有较好的准确度、精密度和稳定性。

2.5.2 AFM1-GFICT 特异性

AFB1非线性四参数拟合EC50为 152.45 pg/mL，AFM1-GFICT 与其交叉反应率为44.9%，而其他3 种真菌毒素不能进行非线性四参数拟合，说明其在5.4 ng/mL时无明显阻断，说明AFM1-GFICT 与它们的交叉反应率小于1%。

表1 AFM1-GFICT 准确度、精密度和稳定性检测结果Table 1 AFM1-GFICT ccuracy，precision and stability test results

2.5.3 AFM1-GFICT 与商业化AFM1-ELISA 试剂盒检测结果的相关性

AFM1-GFICT 与AFM1-ELISA 检测结果的相关性见图12。

图12 AFM1-GFICT 与AFM1-ELISA 检测结果的相关性Fig.12 Correlation between AFM1-GFICT test results and AFM1-ELISA test results

5 份不同品牌的液态奶、5 份不同品牌的生鲜乳及5 种不同类型的奶粉同时用AFM1-GFICT 与AFM1-ELISA 检测，两种方法的测量结果线性拟合方程y=1.68+0.95x（R2=0.976 8），表明 AFM1-GFIT 与 AFM1-ELISA 有较好的相关性。

3 结论

AuNFs 作为标记物比AuNSs 运用于免疫层析试验检测牛奶样品中的AFM1能够有效的提高5 倍左右的检测限。配合纳米金免疫分析读数仪，AFM1-GFICT在20 pg/mL～1 000 pg/mL 用非线性四参数曲线拟合时相关系数R2=0.999 3，其最低检测限为12.3 pg/mL，能够适应欧盟等国家对牛奶样品中AFM1检测要求。在不含 AFM1的牛奶样品中添加 0.1、0.3、0.5 μg/kg 的 AFM1标准品，其回收率分别为80.4%、99.3%和118.2%，每个加标浓度重复检测10 次的变异系数分别为9.43%、8.34 %和4.27 %。15 份牛奶样品的AFM1-GFICT 和AFM1-ELISA 检测结果相比，线性拟合相关系数R2=0.976 8。上述结果表明AFM1-GFICT 有较好的准确度、精密度和较高的灵敏度，可为检测牛奶及其制品中AFM1的污染提供灵敏高效准确的检测方法。