基于HPLC-AFS技术研究南极磷虾油对大鼠脏器中砷形态分布的影响

刘小芳,邱阿敏,唐一新,张辉珍,冷凯良,*

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业农村部极地渔业开发重点实验室,山东青岛 266071; 2.青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋药物与生物制品功能实验室,山东青岛 266200; 3.青岛大学医学院公共卫生学院,山东青岛 266021; 4.青岛市食品药品检验研究院,山东青岛 266071)

南极磷虾是目前唯一尚未大规模开发且储量尤为丰富的单种渔业资源,其资源储量约为6.5～10亿吨,年可捕量相当于目前全球海洋捕捞产量的总和[1]。南极磷虾富含蛋白质、人体所必需的全部氨基酸、Omega-3系列多不饱和脂肪酸、磷脂等,营养价值较高[2-4]。南极磷虾油是以南极磷虾粉为原料经提取精制而得,富含EPA/DHA、磷脂以及虾青素等功能脂质[5-6],具有调节血脂、抗氧化、改善脑细胞功能等多种生理活性[7-9]。2013年我国卫生计生委第16号公告已批准南极磷虾油为新食品原料,目前其市场价格达到每吨70～120万,成为南极磷虾产业最主要的高附加值产品形式。

受原料及加工工艺影响,南极磷虾油中总砷含量较高,约为2.5～8.3 mg/kg,其中主要砷形态是无毒的砷甜菜碱,而毒性较高的AsⅢ和AsⅤ等无机砷含量极低[10]。但受总砷含量较高的影响,人们对南极磷虾油的食用安全性仍存在一定疑虑,这也制约了产品市场的发展。因此,阐释南极磷虾油及其主要砷形态化合物在体内的代谢、蓄积和转化情况至关重要。本课题组前期研究证实,大鼠摄食南极磷虾油及其砷甜菜碱后,85%的砷会在24 h之内随尿液排出体外;连续摄食30 d后,大鼠体重、脏器指数、血清生化指标和组织病理切片分析均未见明显异常[11],肝脏和肾脏中总砷水平亦未出现显著变化。为进一步全面地解释南极磷虾油的食用安全性,本研究继续考察了摄食南极磷虾油及其砷甜菜碱对动物脏器中不同砷形态含量及相互间转化的影响,以期为南极磷虾油的科学消费和应用领域拓展提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级雄性Wistar大鼠 体重180～220 g、生产许可证号SCXK(鲁)20140001,青岛市实验动物和动物实验中心;南极磷虾油 红棕色油状物,贮存于干燥、密封处,总砷含量3.92 mg/kg、无机砷含量0.021 mg/kg、砷甜菜碱含量3.57 mg/kg、二甲基砷含量0.29 mg/kg,青岛南极维康生物科技有限公司;大豆油,总砷含量0.037 mg/kg 嘉里粮油(天津)有限公司;色谱纯甲醇 美国Fisher公司;磷酸二氢铵、盐酸、硼氢化钾、过硫酸钾、氢氧化钾等均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司;亚砷酸根离子(AsⅢ)、砷酸根离子(AsV)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷甜菜碱(AsB)标准溶液 中国计量科学研究院;砷甜菜碱(AsB)标准品(纯度≥95%) 日本Wako公司。

SA5型液相色谱-原子荧光光谱联用仪 北京普析通用仪器有限公司;7500型电感耦合等离子质谱仪 美国Agilent公司;PRPx-100阴离子交换色谱分析柱(250 mm×4.1 mm,10 μm) 瑞士Hamilton公司;Milliplus 2150型超纯水处理系统 美国Millipore公司;30-30K型低温离心机 美国Sigma公司;FA1004N型电子天平 上海民侨精密科学仪器有限公司;T10型组织匀浆器 德国IKA公司;STARTER 3100型pH计 梅特勒托利多有限公司;KQ-500DE型超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及大鼠的饲养 SPF级雄性Wistar大鼠30只,随机分为6组:大豆油对照组(7 d组、30 d组)、南极磷虾油组(7 d组、30 d组)、添加100 mg/kg砷甜菜碱的南极磷虾油组(7 d组、30 d组),根据成人每日膳食油脂推荐摄入量25 g等量换算成大鼠每日灌胃剂量为2.625 g油/kg·bw,以最大程度接受南极磷虾油砷暴露,7 d组连续灌胃7 d,30 d组连续灌胃30 d,饲养环境温度20～25 ℃,湿度40%～70%,标准饲料喂养,自由饮食饮水。实验前禁食不禁水12 h,于末次灌胃后24 h,经戊巴比妥钠麻醉,剥离肝脏、肾脏,液氮速冻后转移至-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 总砷测定 按照GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》中第一法 电感耦合等离子体质谱法的规定执行。

1.2.3 砷形态分析

1.2.3.1 样品前处理 参照Grotti等[12]的方法进行样品前处理。称取0.5～2.0 g大鼠肝脏或肾脏样品,加入25 mL 90%甲醇溶液匀浆,匀浆液于摇床上室温振荡提取过夜,8000 r/min离心5 min,取上清液,旋转蒸发浓缩去除甲醇,超纯水定容至10 mL,经0.45 μm滤膜过滤,待测。

1.2.3.2 液相色谱检测条件 色谱柱:HamiltonPRPx-100阴离子交换色谱分析柱(250 mm×4.1 mm,10 μm);流动相:流动相A为0.8 mmol/L磷酸二氢铵溶液(pH9.0),流动相B为20 mmol/L磷酸二氢铵溶液(pH8.0),梯度洗脱程序见表1;流速:1.0 mL/min;进样量:100 μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Program of the gradient elution

1.2.3.3 原子荧光检测条件 负高压:320 V;灯丝总电流:100 mA,主电流/辅助电流:50/50 mA;载气流速:800 mL/min;原子化器温度:中温;原子化方式:火焰法;载流:10%盐酸溶液,流速4 mL/min;还原剂:3%硼氢化钾溶液(含5 g/L氢氧化钾),流速4 mL/min;氧化剂:0.5%过硫酸钾溶液(含5 g/L氢氧化钾),流速1.5 mL/min。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

本研究分析了流动相磷酸二氢铵溶液的摩尔浓度与pH对五种砷形态出峰时间和分离效果的影响(表2)。结果显示,当磷酸二氢铵溶液浓度小于1.0 mmol/L时,AsB、AsⅢ和DMA三种砷形态化合物可在较短时间内出峰,但MMA和AsV两种砷形态化合物不能在30 min之内完成洗脱;当磷酸二氢铵溶液浓度大于1 mmol/L时,五种砷形态化合物虽能够在较短时间内出峰,但AsB、AsⅢ、DMA等三种砷形态化合物的分离效果不佳。GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》关于无机砷测定的HPLC-AFS法中规定梯度洗脱采用1.0 mmol/L磷酸二氢铵溶液(pH9.0)和20 mmol/L磷酸二氢铵溶液(pH8.0)作为流动相。

表2 流动相摩尔浓度和pH对不同砷形态化合物保留时间的影响Table 2 Effects of the flow phase concentration and pH on the retention times of the five arsenic compounds

本研究发现,采用0.8 mmol/L磷酸二氢铵溶液(pH9.0)与采用1.0 mmol/L磷酸二氢铵溶液(pH9.0)进行洗脱时,效果基本一致。因此,在实际检测时,本研究对国标方法中规定的洗脱条件进行了适当优化,先采用0.8 mmol/L磷酸二氢铵溶液(pH9.0)进行洗脱,再转换为20 mmol/L磷酸二氢铵溶液(pH8.0)进行洗脱,既可保证五种砷形态化合物实现有效分离,又可在20 min内完成检测。在上述梯度洗脱条件下,五种砷形态化合物的色谱分离图谱见图1。

图1 五种砷形态化合物混合标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solutions of the five arsenic compounds

2.2 方法学验证

2.2.1 检出限与定量限 五种砷形态化合物的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分析结果见表3。以信噪比S/N=3对应的浓度点作为方法的LOD,以S/N=10对应的浓度点作为方法的LOQ。AsB和MMA的LOD均为0.35 μg/L,LOQ均为1.0 μg/L;AsⅢ、DMA和AsⅤ的LOD均为0.50 μg/L,LOQ均为2.0 μg/L。

表3 五种砷形态化合物的检出限、定量限、线性范围与精密度Table 3 LOD,LOQ,linearity range and precision of the five arsenic compounds

2.2.2 线性范围与精密度 五种砷形态化合物线性范围与精密度分析结果见表3。结果显示,在5～200 μg/L浓度范围内,五种砷形态化合物的峰面积(Y)与浓度(X)均呈现良好的线性关系,R2大于0.999,可以通过外标法实现准确定量。采用50 μg/L的不同砷形态化合物混合标准溶液,重复进样测定6次,RSD为1.34%～3.97%,方法精密度良好。

2.2.3 加标回收率 为验证方法的准确度,测定了不同砷形态化合物的加标回收率,结果见表4。在20～100 μg/L加标浓度范围内,AsB、AsⅢ、DMA、MMA和AsⅤ的回收率在80.2%～113.0%之间。本分析方法的加标回收效果较好,准确度高,可以用于动物脏器组织中不同砷形态化合物的定量分析。

表4 五种砷形态化合物的加标回收率Table 4 Recoveries of the five arsenic compounds

续表

2.3 大鼠脏器中总砷和不同砷形态化合物的含量

不同实验组大鼠连续灌胃7、30 d后,肝脏和肾脏中总砷和不同砷形态化合物的含量分析结果见表5、表6,砷形态分析图谱见图2、图3。由表5和表6可知,对照组大鼠肝脏总砷含量为1.00～1.16 mg/kg,肾脏总砷含量为1.02～1.07 mg/kg。与对照组相比,连续灌胃7、30 d后,磷虾油组、砷甜菜碱磷虾油组大鼠肝脏和肾脏中总砷含量略有升高,但无显著性差异(p>0.05)。灌胃7 d与灌胃30 d相比较,各实验组大鼠肝脏和肾脏总砷含量水平均基本一致,无显著性差异(p>0.05)。

表5 不同实验组大鼠肝脏中五种砷形态化合物的含量(mg/kg,n=5)Table 5 Contents of the five arsenic compounds in the livers of the experimental rats(mg/kg,n=5)

表6 不同实验组大鼠肾脏中五种砷形态化合物的含量(mg/kg,n=5)Table 6 Contents of the five arsenic compounds in the kidneys of the experimental rats(mg/kg,n=5)

图2 磷虾油组大鼠灌胃30d后肾脏砷形态分析色谱图Fig.2 Chromatogram of five arsenic compounds in the kidney of the rat fed with krill oil for 30 d

图3 砷甜菜碱磷虾油组大鼠灌胃 30d后肝脏砷形态分析色谱图Fig.3 Chromatogram of five arsenic compounds in the liver of the rat fed with arsenobetaine added krill oil for 30 d

砷形态分析结果显示,大鼠肝脏和肾脏中主要的砷形态为AsB,约占总砷含量的80%,其次为DMA,而AsⅢ、MMA和AsⅤ均未检出。连续灌胃7、30 d,磷虾油组、砷甜菜碱磷虾油组大鼠肝脏和肾脏中AsB和DMA含量较对照组均无显著性差异(p>0.05)。灌胃7 d与灌胃30 d相比较,各实验组大鼠肝脏和肾脏中AsB和DMA含量也无显著性差异(p>0.05)。由此可见,磷虾油中的砷甜菜碱在大鼠体内不会产生蓄积作用。

3 讨论

砷在自然环境中主要以有机态和无机态两种形式存在。水产品中砷化合物主要包括AsB、DMA、MMA、砷胆碱(AsC)、砷脂、砷糖等有机砷,以及少量的AsⅢ、AsⅤ等无机砷[13-14]。南极磷虾中最主要的砷赋存形态为AsB,且其在加工过程中,易随着醇提、脱溶、精制等过程而富集至磷虾油中[12,15],含量达到磷虾油总砷含量的90%以上[10,16]。本研究针对膳食摄入磷虾油及其砷甜菜碱是否会在体内转化为无机砷形态,进而引发机体损伤这一科学问题进行了重点考察。研究发现,未给予受试物的大鼠肝脏和肾脏中,砷主要是以AsB和DMA两种形式存在,其它砷形态特别是毒性较大的无机砷未有检出。受仪器检出限以及样品前处理方法不同等的影响,检测到的砷形态总量与总砷含量略有差异。大鼠连续摄食南极磷虾油或添加100 mg/kg砷甜菜碱的南极磷虾油7 d或30 d后,肝脏和肾脏中总砷、AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ含量均未有显著性变化(p>0.05),证明摄入磷虾油乃至超出正常磷虾油中砷甜菜碱30倍含量的供试物并不会引发大鼠脏器中砷的蓄积和砷形态间的相互转化,同时也证明,磷虾油中其他成分也不会对此代谢过程产生不利影响。前人研究报道,砷甜菜碱具有低毒、不代谢的特点[17],其没有明显毒作用的靶器官,不在体内产生蓄积作用[18-20],摄入后主要通过尿液途径排出体外,小部分随胆汁等途径排出,不会在体内代谢转化为其他形式的砷化合物[21-23],与本文的研究结果保持一致。

欧盟食品安全局在《食品中砷的科学观点》中指出砷元素的毒性与其存在形态密切相关,无机砷具有致癌毒性,而有机砷通常被认为是低毒或无毒的[15]。以砷化合物的半数致死量LD50(mg/kg)计,其毒性由大到小依次为As(Ⅲ)(14)>As(V)(20)>MMA(200～1800)>DMA(200～2600)>AsC(>6500)>AsB(>10000)[24-25]。郭莹莹等[26]基于南极磷虾油中总砷和无机砷含量的检测数据,结合南极磷虾油产品的膳食消费量,通过点评估方法对南极磷虾油砷膳食暴露量及食用安全性进行了研究,发现摄食南极磷虾油对无机砷膳食暴露量的贡献率极低,长期食用磷虾油并不会增加总膳食无机砷的摄入。综合以上资料以及本研究的结果可知,长期摄食南极磷虾油并不会带来因总砷、无机砷或有机砷含量问题而引发的健康风险。

4 结论

本研究建立了基于HPLC-AFS技术的动物组织脏器中砷形态分析方法,可实现大鼠脏器中AsB、DMA、MMA、AsⅢ、AsⅤ等五种砷形态化合物的定性和定量,五种砷形态的检出限为0.35～0.50 μg/L,定量限为1.0～2.0 μg/L,方法在5～200 μg/L浓度范围内线性良好,R2>0.999,加标回收率为80.2%～113.0%,RSD为1.34%～3.97%。该方法具有分离度良好,检测限低,准确性高等特点。

大鼠肝脏和肾脏中检出的砷形态化合物主要为AsB和DMA,而AsⅢ和AsⅤ等无机砷形态未有检出。大鼠肝脏中AsB含量为0.80～0.89 mg/kg、DMA含量为0.18～0.19 mg/kg,肾脏中AsB含量为0.82 mg/kg、DMA含量为0.16～0.18 mg/kg。短期或长期摄食南极磷虾油及其砷甜菜碱后,脏器中砷形态的组成和含量均未有显著性变化(p>0.05)。因此,摄食南极磷虾油不会产生脏器砷蓄积现象,同时,摄入的砷甜菜碱也不会在体内向毒性较强的无机砷形态转化。南极磷虾油可以作为安全的食品原料在保健食品、生物医药制品领域予以推广利用。