灵芝三萜酸改善小鼠睡眠作用研究

俞 盈,吴学谦,熊科辉,包国良,许海顺,徐 娟,吴庆其,李青青,么春艳

(浙江省医学科学院,保健食品研究所,浙江杭州 310013)

睡眠是人类和高等动物必须的生理过程,是维持体力和健康的基础。失眠是一种常见的睡眠障碍,指不能入睡或不能维持睡眠状态[1]。慢性失眠的发病率大概为15%[2],短暂性失眠的发病率约为80%[3]。目前对于失眠的治疗以服用人工合成药物为主,然而合成药物存在严重的药物依赖、认知和运动损害、停药反跳性失眠等不良反应。因此,亟需寻找发展安全有效的镇静安神药物,以突破镇静安神药物和饮食补充剂的发展瓶颈。

灵芝为多孔菌科赤芝[Ganodermalucidum(Leyss. ex. Fr.)Karst.]或紫芝[Ganodermajaponicum(Fr.)Lloyd]的干燥子实体,自古就有“仙草”、“瑞草”之称,药用价值极高,是我国珍贵的菌藻类药材。我国人民把它作为药用已有2000多年的历史,周朝古籍《列子》一书中就有“朽壤之上,有菌者芝”。灵芝的“安神”作用始载于《神农本草经》,2005年版《浙江省中药饮片炮制规范》和2010年版《中华人民共和国药典》均记述了灵芝具有“益气安神”作用。

在灵芝的多种活性成分中,水溶性的灵芝多糖和醇溶性的三萜类化合物是主要生物活性成分,其含量高低是衡量灵芝药用价值和品质的重要指标。灵芝多糖一直作为灵芝的主要有效成分,关于灵芝多糖改善睡眠的动物实验研究较多[4-9],也有一些科学研究涉及作用机制及人体试食[10-11],但研究结果并不一致。近年来,灵芝三萜酸作为灵芝的特有成分而备受关注。国内外关于灵芝三萜酸的研究以优化其提取工艺及含量检测居多[12],运用现代药理方法研究灵芝三萜酸镇静安神作用的研究报道并不多见。Cho等[13]应用放射性配体受体结合实验,体外实验证明灵芝子实体醇提物γ-氨基丁酸A(GABAA)受体有中等强度亲和力,其可能通过GABAA受体改善睡眠,但并未进一步在动物体内验证其药理作用。贾薇等[4]研究发现灵芝三萜与茯苓提取物有协同改善睡眠的功能,但作用机制不明确。其他相关研究未见报道,因此,本实验研究通过直接睡眠实验、延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验和巴比妥钠睡眠潜伏期实验研究了灵芝三萜酸的镇静安神作用,为灵芝子实体相关的食品及保健食品研发提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

ICR小鼠,清洁级健康,体重18～22 g,雄性,50只,浙江省医学科学院实验动物中心提供,实验动物生产证许可证号SCXK(浙)2014-0001;赤灵芝子实体 由浙江五养堂药业有限公司提供,产地为浙江五养堂原木灵芝栽培基地,于每年10月进行采摘,65 ℃烘箱干燥12 h,粉碎,过 60目筛备用;95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、NaOH、HCl、冰乙酸、高氯酸、香草醛、吐温80 均为分析纯;齐墩果酸 纯度≥98%,中国食品药品检定研究院;地西泮(Diazepam) Aladdin公司;戊巴比妥钠、巴比妥钠 Merck公司。

UV-3802型紫外分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司;FB224电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;KQ-500B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;RV10旋转蒸发仪 德国IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 灵芝三萜酸的制备及测定 灵芝粗三萜酸的制备及精制参考文献[14],略有修改:赤芝子实体精粉(过60目筛)100 g,95%乙醇20倍量超声提取2次,超声频率40 kHz,每次30 min,合并提取液,真空旋转蒸发干燥。所得浸膏重溶于水,用石油醚除脂,乙酸乙酯萃取3次,所得乙酸乙酯部分旋蒸干燥。将旋蒸干燥的乙酸乙酯部分重溶于乙酸乙酯,碱化至pH9～10,水洗至中性,将萃取得到的碱化水层酸化至pH2～3,用乙酸乙酯萃取3次得到粗灵芝三萜酸部分,将灵芝三萜酸部分旋蒸干燥即为含量测定及实验动物灌胃用样品。

灵芝三萜酸含量的测定方法参见文献[15],略作修改:灵芝三萜酸样品0.24 g置于容量瓶中,加入乙酸乙酯溶解,超声振动溶解,过滤定容至50 mL,用香草醛-高氯酸显色反应测定灵芝三萜酸的含量。样品于548 nm处测定吸收值,以吸光值为纵坐标,以齐墩果酸含量为横坐标作标准曲线,得出回归方程,并计算受试物灵芝三萜酸的含量。

1.2.2 小鼠体重测定实验 ICR小鼠饲养于浙江省医学科学院实验动物中心SPF级动物房,温度为22～25 ℃,相对湿度为40%～70%,光照-黑暗循环为12 h∶12 h,自由饮水摄食。动物实验通过本单位实验动物伦理委员会批准。实验开始前,称量实验小鼠初始体重,并根据小鼠体重分为5组,分别是溶剂对照组(5% 吐温80,10 mL/kg·bw)、阳性对照组(地西泮,2.5 mg/kg·bw)、灵芝三萜酸低剂量组(25 mg/kg·bw)、中剂量组(50 mg/kg·bw)、高剂量组(100 mg/kg·bw),每组10只。各组动物每天灌胃1次,连续灌胃30 d,每周于灌胃结束后称取小鼠体重1次。

1.2.3 直接睡眠实验 各组动物每天分别给予相应的受试物,观察灌胃后30 min内,小鼠是否出现睡眠现象,以动物的翻正反射消失超过60 s判为进入睡眠,翻正反射恢复即为动物觉醒[16]。比较溶剂对照组、灵芝三萜酸各剂量组对小鼠直接催眠的影响。

1.2.4 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验 在戊巴比妥钠催眠的基础上,观察各受试物是否延长睡眠时间,若睡眠时间延长,则说明受试物与戊巴比妥钠有协同作用[16]。各组小鼠每天给予灵芝三萜酸1次,连续30 d,于末次给予前12 h禁食不禁水。末次灌胃60 min后,各组小鼠给予48 mg/kg·bw戊巴比妥钠(i.p.),注射量为0.1 mL/10 g·bw。以小鼠的翻正反射消失60 s以上作为入睡判断标准,以动物注射戊巴比妥钠到翻正反射消失的时间作为睡眠潜伏期,动物翻正反射消失到恢复这段时间为动物睡眠时间,比较各受试物能否缩短戊巴比妥钠注射小鼠的入睡潜伏期,延长睡眠时间。

1.2.5 戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验 各组小鼠每天给予灵芝三萜酸1次,连续30 d,于末次给药予12 h禁食不禁水。在末次灌胃60 min后,各组动物(i.p.)给予32 mg/kg·bw戊巴比妥钠,注射量为0.1 mL/10 g·bw,以小鼠的翻正反射消失达60 s以上作为入睡判断标准,记录30 min内各组入睡动物数并计算睡眠发生率。睡眠发生率(%)=(入睡动物数/每组动物数)×100[14]。

1.2.6 巴比妥钠睡眠潜伏期实验 在巴比妥钠催眠的基础上,观察受试物是否能够缩短动物的入睡潜伏期,若潜伏期缩短,则说明受试物与巴比妥钠有协同作用[16]。各组小鼠每天给予灵芝三萜酸1次,连续30 d,于末次给药予12 h禁食不禁水。各剂量组在末次灌胃60 min后,各组动物按280 mg/kg·bw给予巴比妥钠(i.p.),注射量为0.1 mL/10 g·bw,以小鼠翻正反射消失60 s以上作为入睡指标,从注射巴比妥钠到动物入睡即为睡眠潜伏期,观察各组受试物能否缩短巴比妥钠睡眠潜伏期。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 灵芝三萜酸的含量

灵芝三萜酸经过提取及初步精制,去除脂肪酸等小极性化合物产生的干扰,以吸光值为纵坐标,以齐墩果酸含量为横坐标,得到回归方程y=9.7202x+0.0033,r=0.9997。根据回归方程计算得出受试物灵芝三萜酸的含量为11.49%。

2.2 灵芝三萜酸对小鼠体重的影响

灵芝三萜酸25、50、100 mg/kg剂量组的实验小鼠初始体重与溶剂对照组(吐温80)和阳性对照组(地西泮)比较差异均不显著(p>0.05)(表1),连续灌胃给予受试物30 d后,灵芝三萜酸各剂量组实验小鼠体重与溶剂对照组和阳性对照组均没有显著性差异(p>0.05)(表1),表明灵芝三萜酸对小鼠体重无明显影响,在本实验设计剂量下对小鼠体重未显示出明显的不良作用。

表1 灵芝三萜酸对小鼠体重的影响(n=10)Table 1 Effect of triterpene acids of G. lucidum on body weight of mice(n=10)

2.3 灵芝三萜酸对直接睡眠的影响

各组小鼠在给予受试物60 min内,通过实验观察,灵芝三萜酸组和溶剂对照组均未有直接睡眠现象发生,即灵芝三萜酸及对照溶剂对小鼠均无直接催眠作用,推测其与其他药物协同使用产生的中枢镇静作用可能是其改善小鼠睡眠的主要作用机制。

2.4 灵芝三萜酸对戊巴比妥钠诱导睡眠时间的影响

按照《保健食品检验与评价技术规范》对灵芝三萜酸进行延长戊巴比妥钠睡眠时间实验,研究其对小鼠睡眠时间的影响。在戊巴比妥钠催眠的基础上,若睡眠时间延长,则说明受试物与戊巴比妥钠有协同作用[16]。结果见图1A,阳性对照组小鼠的睡眠潜伏期(237.08±14.37) s极显著低于溶剂对照组(297.14±22.62) s(p<0.01),灵芝三萜酸低、中、高剂量组小鼠睡眠潜伏期随剂量缩短,分别为(260.87±16.67)、(250.24±55.57)、(252.73±36.43) s;灵芝三萜酸50和100 mg/kg组与溶剂对照相比均差异显著(p<0.05),而灵芝三萜酸25 mg/kg组与溶剂对照组相比,其睡眠潜伏期降低12.21%,但不具有显著性差异(p>0.05)。说明灵芝三萜酸与戊巴比妥钠具有协同作用,50和100 mg/kg剂量与一定剂量戊巴比妥钠联合作用能够缩短小鼠的入睡时间。

实验小鼠的睡眠时间结果见图1B,灵芝三萜酸25、50、100 mg/kg剂量组的睡眠时间为(2474.86±755.91)、(2941.43±587.57)、(3541.25±500.67) s,与溶剂对照组(1554.14±395.64) s比较,灵芝三萜酸各剂量组小鼠睡眠时间分别延长59.24%、89.26%、127.86%,均具有极显著差异(p<0.01),且随着剂量增加睡眠时间增长。阳性对照组地西泮的睡眠时间为(3346.67±537.96) s,睡眠时间延长115.34%,与溶剂对照组相比差异极显著(p<0.01)。灵芝三萜酸高剂量组100 mg/kg的睡眠时间强于阳性对照组。说明一定剂量的灵芝三萜酸与戊巴比妥钠有协同作用,可以极显著(p<0.01)缩短小鼠的睡眠潜伏期并延长小鼠睡眠时间。

图1 灵芝三萜酸对戊巴比妥钠诱导睡眠时间的影响(n=10)Fig.1 Effect of G. lucidum triterpene acids on pentobarbital-induced mice(n=10)注:A:灵芝三萜酸对戊巴比妥钠致睡眠小鼠睡眠潜伏期的影响;B:灵芝三萜酸对戊巴比妥钠致睡眠小鼠睡眠时间的影响;*:与溶剂对照组比较差异显著,p<0.05;**:与溶剂对照组比较差异极显著,p<0.01；图2、表2同。

目前国内外文献未见单独对灵芝三萜酸进行睡眠作用研究的相关报道。在灵芝水提物方面,Chu等[5]报道40 mg/kg的灵芝水提物与戊巴比妥钠协同后,与空白对照组相比,未能显著延长大鼠睡眠时间;80和120 mg/kg剂量的灵芝水提物与对照组相比,睡眠时间延长了50%和60%左右。本实验研究结果提示,与空白对照组相比,灵芝三萜酸50和100 mg/kg的睡眠时间分别延长89.26%和127.86%。基本这一对比数据,灵芝三萜酸改善睡眠的作用效果优于灵芝水提物。

2.5 灵芝三萜酸对戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验的影响

对灵芝三萜酸进行戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验,研究其对小鼠睡眠发生率的影响。由于戊巴比妥钠通过肝酶代谢,而对该酶有抑制作用的药物,也能延长戊巴比妥钠睡眠时间。为了排除这种影响,降低戊巴比妥钠的剂量,进行阈下催眠实验[16]。结果见表2。从实验结果可以看出,灵芝三萜酸低、中、高剂量组的睡眠发生率分别为30%、50%、80%,均高于溶剂对照组的睡眠发生率(20%),且随着受试物剂量的增加,睡眠发生率逐渐增加;灵芝三萜酸高剂量组100 mg/kg的睡眠发生率(80%)高于阳性药物地西泮(60%)。与溶剂对照组相比,灵芝三萜酸25、50 mg/kg、地西泮组的睡眠发生率增加却不具有显著性差异(p>0.05),灵芝三萜酸100 mg/kg组与溶剂对照组相比显著差异(p<0.05)。以上结果表明,灵芝三萜酸与戊巴比妥钠的协同睡眠作用并非通过影响戊巴比妥钠的代谢过程而实现的。同时,其与戊巴比妥钠协同睡眠实验结果类似,在戊巴比妥钠阈下催眠剂量睡眠实验中同样发现灵芝三萜酸100 mg/kg·bw的促睡眠效果强于阳性对照地西泮2.5 mg/kg。

表2 灵芝三萜酸对戊巴比妥钠阈下剂量 睡眠发生率的影响(n=10)Table 2 Effect on sleeping rate of G. lucidum triterpene acids on the subthreshold of pentobarbital sodium in mice(n=10)

2.6 灵芝三萜酸对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响

按照《保健食品检验与评价技术规范》[16]对灵芝三萜酸进行巴比妥钠睡眠潜伏期实验,研究其对小鼠入睡时间的影响,结果见图2。从实验结果中可以看出,在巴比妥钠睡眠潜伏期实验中,灵芝三萜酸25、50、100 mg/kg的睡眠潜伏期分别为(1712.74±177.35)、(1632.00±301.95)、(1091.58±162.44) s,与溶剂对照组(2158.09±205.49) s比较,均能极显著缩短小鼠睡眠潜伏期(p<0.01),表明灵芝三萜酸促进小鼠入睡作用良好,且随三萜酸剂量的增加,其促进睡眠效果呈增强趋势;灵芝三萜酸高剂量组100 mg/kg促进睡眠作用(1091.58±162.44) s,强于地西泮2.5 mg/kg催眠作用(1212.84±107.54) s。因此,灵芝三萜酸低、中、高剂量组均能极显著(p<0.01)缩短小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期,与巴比妥钠协同促进睡眠效果更明显。

图2 灵芝三萜酸对巴比妥钠睡眠潜伏期实验的影响(n=10)Fig.2 Effect of G. lucidum triterpene acids on barbital sodium sleep incubation period test in mice(n=10)

从戊巴比妥钠诱导睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验及巴比妥钠睡眠潜伏期实验结果可以看出,灵芝三萜酸与戊巴比妥钠、巴比妥钠均具有较好的协同作用,既能促进睡眠的发生,也有助于睡眠的维持。而灵芝三萜酸对睡眠的调节作用机制由经典神经递质、非典型性神经递质、细胞因子、激素或肽类中的一种或多种机制共同参与则有待于进一步深入研究。

3 结论

本实验研究通过直接睡眠实验、延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验和巴比妥钠睡眠潜伏期实验研究了自制灵芝三萜酸的改善睡眠作用。根据《保健食品检验与评价技术规范》[16],延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验和巴比妥钠睡眠实验中,两个实验结果呈现阳性,即可判定受试物具有改善睡眠的效果。本研究显示,灵芝三萜酸延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验和巴比妥钠睡眠实验中的结果均呈现阳性,且100 mg/kg剂量组在三个实验中的促睡眠效果强于阳性对照地西泮(2.5 mg/kg),说明灵芝三萜酸具有很好的改善睡眠的作用。

综上所述,本实验研究通过对灵芝三萜酸促进睡眠的研究,确定灵芝三萜酸具有明显的改善睡眠作用,关于灵芝三萜酸改善睡眠作用的作用机制本课题组将进一步研究。