硬毛粗盖孔菌产漆酶条件优化及其对日落黄的降解作用

宋丽丽,张志平,王光路,杨 旭,张靖楠

(郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州 450002)

漆酶(Laccase,ρ-diphenoloxidase,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,广泛存在于植物、动物、昆虫、细菌和真菌中,漆酶通过获得O2催化邻对位苯二酚、多酚、对苯二胺、抗坏血酸等物质的氧化,使之生成相应的苯醌和水[1-3]。由于漆酶具有广泛的底物专一性,可催化多种芳香族化合物,在造纸工业、环境保护、食品工业、生物传感器、生物监测等领域应用广泛[4]。在食品工业中,漆酶主要在果汁加工、葡萄酒酿造、面粉改良、食用菌栽培、食品检测、食品废水处理等方面具有重要的应用价值,是当今研究的热点[5]。关于漆酶的研究多集中于担子菌门(Basidiomycete)的白腐真菌(White rot fungi),而真菌漆酶活性受到多种条件的影响[6]:碳源或氮源的种类及浓度;金属离子的种类及浓度(如Cu2+);诱导物,如藜芦醇、阿魏酸等;培养条件,如温度和pH;菌株特性等。尽管自然界中漆酶分布广泛,但高产漆酶菌株并不多,通过优化培养条件提高漆酶产量仍然是主要的研究手段[7]。

食用合成色素从结构上可以分为偶氮类和非偶氮类两类,我国食品添加剂使用卫生标准批准使用的偶氮类色素主要有柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红等[8]。日落黄又名晚霞黄、夕阳黄、食用色素3号、橘黄等,其分子结构见图1,日落黄作为一种人工合成食品添加剂,被广泛应用于食品、化妆品和药物的着色[9]。由于日落黄具有耐热、耐光性强,难于自然降解,且偶氮类合成色素多分子中含有偶氮键和芳香环,如超量违规使用则对人体造成危害[10]。因此需寻求高效绿色降解方法,以减少偶氮类合成色素对人体的伤害及对环境的污染。

图1 日落黄的分子结构式Fig.1 Molecular structure of sunset yellow

硬毛粗盖孔菌(Funaliatrogii)属于非褶菌目多孔菌科粗毛盖孔菌属,产漆酶活力较强,在漆酶资源开发、染料脱色等方面具有较大的应用前景[11-12]。本文以硬毛粗盖孔菌为出发菌株,研究培养基组成及培养条件对该菌产漆酶活性的影响,并研究漆酶粗酶液对合成色素日落黄的降解,对今后漆酶资源在食品行业开发具有重要的理论意义和广泛的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

硬毛粗盖孔菌(F.trogii)菌株 由郑州轻工业学院生物能源与系统生物学研究室提供;2,2′-联氨-双-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、偶氮合成色素日落黄(Sunset yellow) 购于美国Sigma公司;葡萄糖、乳糖、氯化铵、酒石酸铵、硫酸铜、曲酸等 购于国药集团化学试剂有限公司;马铃薯琼脂培养基(PDA培养基),马铃薯肉汤培养基(PDB培养基) 购于北京奥博星生物技术有限责任公司;基础产酶培养基(g/L):葡萄糖20,NH4Cl 2.5,K2HPO43,MgSO4·7H2O 0.2,pH自然,121 ℃灭菌20 min。

UV-1800双光速紫外-可见光光度计 上海欣茂仪器有限公司;SW-CJ-1D净化工作台 苏州净化设备有限公司;LRH-1500F生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;QYC-2012C恒温摇床 上海福玛实验设备有限公司;LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 种子液的制备 将斜面菌株接种到PDA平板中,28 ℃下培养至菌丝体长满整个平板(约7 d),用无菌打孔器取3块接种块(直径1cm)接入PDB培养基中,150 r/min、28 ℃培养5 d,为一级种子液。

1.2.2 硬毛粗盖孔菌液体发酵产漆酶 将5 mL一级种子液接入100 mL已灭菌的基础产酶培养基(100 mL/250 mL)中,28 ℃、150 r/min条件下,培养12 d,期间对漆酶活性峰值进行监测,以确定最佳发酵时间,进行后续实验。

1.2.3 漆酶粗酶液制备 发酵产酶结束后,取发酵液,8000 r/min、4 ℃离心10 min,上清液即为漆酶粗酶液。经适当稀释后测定其漆酶活性。

1.2.4 漆酶活力的测定 反应体系为1.5 mL适当稀释(使吸光度范围为0.2～0.8)的粗酶液和1.5 mL ABTS(50 mmol/L,pH4.8)在420 nm处室温下测定吸光度,每15 s记录一个数据,测定3 min内反应液的吸光度变化[13]。漆酶(Lac)酶活定义为每分钟转化底物的μmol数(ε420=3.6×104L/mol/·cm)为一个酶活力单位(U)。酶活以U/mL表示。

1.2.5 生物量的测定 以菌丝体干重表示,发酵液经8000 r/min室温离心10 min、蒸馏水洗涤后收集菌丝体,置70 ℃烘箱中干燥48 h至恒重(以g/L表示)[14]。

1.2.6 漆酶发酵条件选择

1.2.6.1 最适碳源的选择 基础产酶培养基中分别以20 g/L乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉、玉米淀粉替代葡萄糖作为唯一碳源,培养基其它成分不变,将5 mL一级种子液接入基础产酶培养基中,28 ℃、150 r/min摇床培养,以1.2.2实验确定发酵时间为8 d,测定发酵液漆酶酶活。在确定最适碳源的基础上,分别比较不同浓度(5、10、15、20、25、30、35 g/L)碳源添加量对菌体产漆酶的影响。

1.2.6.2 最适氮源的选择 基础产酶培养基中分别以2.5 g/L酒石酸铵、硝酸钾、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏替代氯化铵为唯一氮源,培养及测定条件同1.2.6.1。在确定最适氮源的基础上,分别比较不同浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L)氮源添加量对菌体产漆酶的影响。

1.2.6.3 Cu2+及诱导剂的选择 在确定碳、氮源种类及含量的基础上,在培养基中加入CuSO4,分别调节培养基中Cu2+终浓度为0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mmol/L,测定漆酶酶活。选择邻苯二酚、藜芦醇、香兰素、愈创木酚、阿魏酸作为诱导剂,发酵第3 d加入培养基,控制其终浓度均为1 mmol/L,测定漆酶酶活。培养及测定条件同1.2.6.1。

1.2.6.4 最适培养条件的选择 在确定培养基组成的基础上,调节培养温度分别为26、28、30、32、34、37 ℃,150 r/min摇床培养8 d,测定发酵液漆酶酶活;调节培养基初始pH3、4、5、6、7、8、9,30 ℃,150 r/min摇床培养8 d,测定发酵液漆酶酶活;调节摇床转速分别为0(静置培养)、50、100、150、200、250、300 r/min,培养基初pH为6,30 ℃培养8 d,测定发酵液漆酶酶活。

1.2.7 漆酶粗酶液对日落黄的降解 以1.2.6确定的漆酶最适发酵培养基组成及发酵条件的基础上,参考徐春燕等[15]实验方法,研究漆酶粗酶液对日落黄的降解影响。其中降解反应体系为200 U/mL粗酶液,50 mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.8),日落黄浓度分别为50、100、200、400、600、800 mg/L。30 ℃恒温静置避光反应,分别在反应的第0、0.5、1、2、3、5、10、24 h测定日落黄在其最大吸收波长处的吸光值。日落黄脱色率按如下方法计算:

式中,A0为对照的吸光度,At为反应t小时后样品的吸光度。以灭活的酶液为对照。

1.2.8 漆酶介体及抑制剂对日落黄降解的影响 分别选择100和600 mg/L日落黄作为底物终浓度,在反应体系中添加200 μL 10 mmol/L ABTS,其它条件同1.2.7,对比漆酶与漆酶-介体系统对日落黄的脱色情况。在漆酶粗酶液中添加曲酸,使其终浓度分别达到0、10、20、30、40、50、100 mmol/L,测定在该浓度下漆酶酶活;取被不同浓度曲酸抑制的漆酶粗酶液,日落黄底物浓度为100 mg/L,测定漆酶对日落黄的脱色情况,反应条件同1.2.7。

1.3 数据处理

实验平行3次,采用Origin 8.0软件进行数据处理及作图。

2 结果与分析

2.1 硬毛粗盖孔菌的生长曲线及产酶曲线

如图2所示,在基础产酶培养基中,随着培养时间的延长,生物量逐渐增加,在7～10 d生物量基本稳定,此后菌体生物量逐渐降低,推测是由于培养基中营养成分耗尽,菌体自溶导致。在菌体培养初期(0～4 d),生物量快速增加,而漆酶活力较低(<5 U/mL),漆酶本身作为一种诱导酶,其分泌及活性受到菌体生长及代谢的影响,菌体快速生长阶段则漆酶分泌量较低,只有当菌体达到一定浓度时,才会启动漆酶合成[16]。菌体培养5 d后漆酶活力快速提升,在第8 d达到最高,为27.50 U/mL,此后漆酶活性逐渐降低,因此将硬毛粗盖孔菌发酵产漆酶时间定为8 d。

图2 培养时间对硬毛粗盖孔菌菌丝体生长及漆酶活力的影响Fig.2 Effect of culture period on mycelial growth and laccase activity of F. trogii

2.2 漆酶发酵条件的选择

2.2.1 碳源及浓度对发酵产漆酶的影响 单糖利于微生物的生长利用,但不利于漆酶的分泌,多糖难以被直接利用,影响菌体生长,但作为迟效碳源,有利于漆酶的分泌[17]。本研究中,玉米淀粉对硬毛粗盖孔菌产漆酶的促进作用最强,漆酶活力达到最高,为32.53 U/mL,其次是甘油,由于甘油作为一种小分子,易于被细胞利用,因此同样呈现出促进漆酶发酵的能力。硬毛粗盖孔菌对多糖的利用能力较强,因此选择以玉米淀粉作为最适碳源。分别比较不同浓度玉米淀粉对菌体发酵产漆酶的影响,结果如图3B所示,由于碳源缺乏,低浓度玉米淀粉(如5 g/L)导致菌体生长不足进而影响漆酶的分泌。随着碳源浓度的升高,漆酶活力逐渐增加,当玉米淀粉浓度为25 g/L,漆酶活力达到最大,随后反而降低,因此选择以25 g/L玉米淀粉作为最适碳源添加浓度。

图3 碳源种类(A)及含量(B)对硬毛粗盖孔菌发酵产漆酶的影响Fig.3 Effect of carbon sources and concentrations on the laccase production of F. trogii

2.2.2 氮源及浓度对发酵产漆酶的影响 不同氮源种类对菌体产漆酶的影响如图4A所示,有机氮源对漆酶的发酵优于无机氮源,与陶君等[18]的研究结果一致。无机氮源中硝酸钾和尿素对漆酶的分泌不利,推测可能由于菌株受不同氮源诱导产漆酶的效应不同,而酒石酸铵对硬毛粗盖孔菌产漆酶促进作用较强,可见菌体对铵态氮的利用优于硝态氮。有机氮源中蛋白胨对漆酶的促进作用最强,漆酶活力达46.23 U/L,因此选择以蛋白胨作为最佳氮源。分别加入不同浓度的蛋白胨,比较氮源浓度对菌体发酵产漆酶的影响,结果如图4B,漆酶活力随氮源浓度升高而增加,当蛋白胨浓度为2 g/L,漆酶活力达到最高,为51 U/mL,继续增加浓度漆酶活力反而下降。因此,本研究中选择以2 g/L蛋白胨作为最适氮源添加浓度。

图4 氮源种类(A)及含量(B)对硬毛粗盖孔菌发酵产漆酶的影响Fig.4 Effect of nitrogen sources and concentration on the laccase production of F. trogii

2.2.3 Cu2+及诱导剂对发酵产漆酶的影响 漆酶作为一种含铜多酚氧化酶,铜离子作为其酶活中心,能通过诱导基因表达、翻译和翻译后调控等方式调控漆酶的合成[19-21]。图5表明低浓度Cu2+对漆酶有较强的诱导作用,漆酶活力随着Cu2+浓度增加而增强,当Cu2+浓度为1.5 mmol/L,漆酶活力达到最高,为121 U/mL,是未诱导前的2.52倍,继续增加Cu2+浓度,漆酶活性呈下降趋势,高浓度Cu2+对菌体生长有抑制作用,不利于漆酶的生产。因此选择以1.5 mmol/L作为Cu2+最适添加浓度。

图5 Cu2+浓度对硬毛粗盖孔菌发酵产漆酶的影响Fig.5 Effect of copper ion concentrations on the laccase production of F. trogii

漆酶作为一种诱导酶,加入诱导剂通常可以提高漆酶的生产活力,由于多数诱导剂对菌体生长不利,因此诱导剂通常在菌体生长一段时间后加入[22]。由图6可知,不同种类的诱导剂对硬毛粗盖孔菌产漆酶均有促进作用,其中香兰素的促进作用最强,其漆酶活力较对照提高了92%。

图6 不同诱导剂对硬毛粗盖孔菌发酵产漆酶的影响Fig.6 Effects of inducers on the laccase production of F. trogii

2.2.4 培养条件对硬毛粗盖孔菌发酵产漆酶的影响 在确定培养基组成的基础上,进一步考察培养条件对硬毛粗盖孔菌发酵产漆酶的影响,主要条件有温度(图7A)、初始pH(图7B)和摇床转速(图7C)。结果表明,培养温度在28～32 ℃之间,漆酶活力均较高,培养温度高于30 ℃时,漆酶活力随着温度升高呈现下降趋势,因此选择以30 ℃作为最佳培养温度。当培养基初始pH偏碱性条件下(pH为8～9),漆酶活力下降明显,pH在4～7范围内,酶活较高,pH为6时漆酶活力最高,研究报道初始pH为酸性对菌体发酵产漆酶有利,菌种发酵产漆酶多为偏酸性环境(pH4.5～6)[23],因此选择pH6.0作为培养基初始pH。

图7 不同培养条件对硬毛粗盖孔菌发酵产漆酶的影响Fig.7 Effect of culture conditions on the laccase production of F. trogii注:A:温度;B:初始pH;C:摇床转速。

由图7C可知,当静置培养(摇床转速为0),培养基中溶氧量较低,漆酶生产较低,硬毛粗盖孔菌为严格好氧菌,氧气对菌体生长及产酶至关重要[24]。随着摇床转速提升,培养基中溶氧量逐渐增多,漆酶活力随之提高,当摇床转速超过200 r/min时,漆酶活力下降,转速过高会造成剪切力过大,不利于菌体的生长。因此选择以200 r/min作为最适摇床转速。

通过研究培养基组成及培养条件对硬毛粗盖孔菌发酵产漆酶的影响,确定其最适发酵条件为:碳源为玉米淀粉(25 g/L),氮源为蛋白胨(2 g/L),Cu2+添加量为1.5 mmol/L,诱导剂为香兰素(1 mmol/L),培养温度30 ℃、初始pH为6.0,摇床转速为200 r/min,在此条件下硬毛粗盖孔菌发酵8 d,其胞外漆酶活力最高为329 U/mL,是初始培养条件下的11.96倍。由于漆酶的活性受到培养因素等多方面的影响,因此优化培养条件是漆酶工作的研究重点。杨咏洁等[25]通过研究碳源、氮源及pH等不同培养条件对火红密孔菌分泌产漆酶能力的影响,经优化后,漆酶活力最高达到238 U/mL,徐春燕等[15]研究培养基、诱导剂、Cu2+对胶质射脉革菌发酵产酶的影响,发现甘草渣与Cu2+复合诱导作用下,胶质射脉革菌胞外漆酶活力最高达到325.1 U/mL。本研究中比较培养基组成及培养条件对硬毛粗盖孔菌产漆酶的影响,其胞外漆酶活力较初始培养条件有显著提升,基于此,进一步考察漆酶对食用合成色素日落黄的降解脱色情况。

2.3 漆酶对不同浓度日落黄脱色效果比较

提取发酵后的粗酶液,考察漆酶粗酶液对不同浓度日落黄脱色效果的影响,结果如图8,在低浓度水平下(50～200 mg/L),漆酶对日落黄的降解显著,10 h脱色率均达到90%以上,24 h后对50、100、200 mg/L日落黄的脱色率分别为95.35%、94.45%、91.34%。随着日落黄浓度的增加,漆酶对其脱色率逐渐降低。当日落黄浓度达到800 mg/L时,反应体系在10 h即达到饱和,脱色率基本保持不变。由于高浓度色素条件下,漆酶活性中心达到饱和,同时色素本身对漆酶的催化作用有负面影响,最终造成其脱色率较低[26]。郑苗苗等[27]研究了红平菇漆酶对不同合成染料的降解,漆酶对40 mg/L偶氮类甲基橙24 h的降解率为45%,本研究中,硬毛粗盖孔菌胞外漆酶对不仅偶氮类色素的脱色作用显著,并且可以耐受较高的底物浓度(800 mg/L),表明该漆酶在偶氮类色素降解方面具有较大的应用前景。

图8 漆酶粗酶液对不同浓度日落黄的降解Fig.8 The decolorization of crude laccase to different concentrations of sunset yellow

2.4 漆酶介体及抑制剂对日落黄脱色的影响

为进一步验证漆酶对日落黄的脱色,分别考察了漆酶介体ABTS及漆酶抑制曲酸对日落黄脱色的影响。

2.4.1 ABTS对日落黄的脱色影响 高活性ABTS不仅是漆酶的特殊底物,也是使用广泛的介质之一,ABTS与漆酶形成LMS(laccase mediator system),ABTS充当“电子梭”,可在漆酶与底物之间发挥电子传递的作用,不仅拓宽作用底物范围,同时提高漆酶的催化效率[28]。本研究分别选择100和600 mg/L日落黄作为底物浓度,对比漆酶与漆酶-介体系统(LMS)对日落黄的脱色情况,结果如图9,漆酶-介体系统可显著提升日落黄的降解效率,日落黄低浓度体系下(100 mg/L)3 h脱色率已达到87.54%,5 h脱色率已基本达到平衡,当日落黄浓度为600 mg/L时,漆酶-介体系统对日落黄的脱色作用增强,最终脱色率为92.45%,对比不添加介体系统的脱色率仅为84.45%。小分子介体(ABTS)的加入,不但可以提升漆酶对日落黄的脱色效率,而且还可以加快底物的脱色速率,降低高浓度底物对漆酶的抑制作用。

图9 漆酶介体对日落黄脱色的影响Fig.9 The effect of laccase mediator on decolorizaiton of sunset yellow

2.4.2 抑制剂曲酸对漆酶降解日落黄的影响 曲酸是漆酶特异性的抑制剂,在反应体系中加入曲酸对漆酶活性产生抑制作用[29]。结果如图10所示,随着曲酸浓度的升高,漆酶活力逐渐被抑制,当曲酸浓度达到100 mmol/L时,与未添加曲酸对照相比,漆酶活力丧失了93.20%。由于曲酸的加入使得漆酶活性受到抑制,日落黄的脱色率也随之降低,当曲酸浓度为100 mmol/L时,日落黄脱色率仅为7.14%,较未添加曲酸的对照组降低了92.57%。表明漆酶在对日落黄的降解脱色中发挥了重要作用。

图10 不同浓度曲酸对漆酶酶活的抑制及日落黄脱色的影响Fig.10 The effect of different concentrations of kojic acid on laccase activity inhabition and decolorization of sunset yellow

3 结论

硬毛粗盖孔菌最适发酵产漆酶条件为:碳源为玉米淀粉(25 g/L),氮源为蛋白胨(2 g/L),Cu2+添加量为1.5 mmol/L,诱导剂为香兰素(1 mmol/L),培养温度30 ℃、初始pH为6.0,摇床转速为200 r/min,培养8 d后漆酶活力最高为329 U/mL,是初始培养条件下的11.96倍。漆酶粗酶液对日落黄显示出较强的降解脱色作用,并可耐受较高的底物浓度,该漆酶对偶氮类色素具有较好的降解脱色效果。漆酶介体ABTS的加入可显著提升漆酶对日落黄的脱色速率及脱色效率:当日落黄浓度为100 mg/L时,5 h脱色率基本已达到平衡,600 mg/L日落黄底物浓度下脱色率可达92.45%;而漆酶抑制剂曲酸的加入降低了漆酶活性,当曲酸浓度为100 mmol/L时,日落黄脱色率仅为7.14%,表明漆酶在偶氮类合成色素降解脱色中发挥了重要作用。硬毛粗盖孔菌作为产漆酶优势菌株,对今后漆酶在合成色素降解的应用具有重要的意义。