QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定猪肉中多类兽药残留

马哲贵，游 琼

（1.江西九州检测检验有限公司；2.江西省农产品质量安全检测中心）

小规模猪场和农户散养是我国传统生猪养殖模式，兽药被养殖户用于防治疾病、促进生长、降低死亡率。但是，不遵循休药期、兽药滥用等，生猪体内大量残留药物及其代谢物，这些具有大量药物残留的生猪一旦流入市场，人们吃了这样的猪肉，会给人们身体健康带来严重危害。大环内酯类、四环素类、皮糖质激素类、β-内酰胺类、硝基咪唑类和喹诺酮类这6种是最常用的兽药，而且很容易被滥用的兽药，国家235号公告对这些兽药进行了最高残留限量标准[1]。因此，要研究实践快速检测方法对猪肉兽药残留进行有效检测。

目前，国标方法[2-6]大部分都是以分类检测为主，优点是样品前处理适用范围广，缺点是一个样本要进行多次检测，这就需要投入大量资金和人员。超高效液相色谱-串联质谱法具有高效选择、灵敏度等优势，在兽药残留分析中被广泛应用，但在猪肉中同时检测硝基咪唑类、β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、糖皮质类激素和喹诺酮类6类兽药还鲜有报道。QuEChERS方法具有操作简单、快速、样品用量少、试剂消耗少等特点，兽药残留检测时被广泛运用。本研究运用改良的QuEChERS方法对猪肉样品进行提取、净化，可以同时有效检测猪肉样品中6类22种兽药残留。与国标方法比较，本研究所用方法检查更加快速、操作更简单、使用成本更低，建议广泛运用到猪肉兽药残留检测实践中。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

美国安捷伦公司生产的6460C型超高效液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾离子（ESI）源；湘仪离心机仪器有限公司生产的H2100R台式高速冷冻离心机；美国Millipore公司生产的Milli-Q超纯水仪。

22种兽药标准引进德国Dr.Ehrenstorfer公司（见表1）；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，购自Honeywell公司；甲酸(色谱纯)，购自天津科密欧化学试剂有限公司；吸附剂NH2购自日本岛津公司；吸附剂C18，购自美国安捷伦公司；乙二胺四乙酸二钠、无水硫酸钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、氢氧化钠均为分析纯，购自广东汕头市西陇化工厂；水是超纯水。

Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：磷酸二氢钠10.9g，柠檬酸12.9g，乙二胺四乙酸二钠37.2g，用水溶解，定容至1L（溶液PH值约4.0）。

1.2 标准溶液的配制

分别称取一定量的兽药标准品，用甲醇进行溶解，定容成1g/L质量浓度的单标储备液，置于-18℃环境中保存。用甲醇将四环素类储备液稀释至100mg/L，其余储备液稀释至10mg/L作为混合标准中间液，检测时根据需要取用。使用时需要用0.1%甲酸水-乙腈（90：10，v/v)进行逐级稀释配制成新鲜的混合标准工作液。

1.3 样品处理

分取均质样品2.0g（精确到0.1g），放置于50mL离心管中，将0.1moL/L Na2EDTA-Mcllvaine的缓冲液0.5mL加入其中，使用涡旋将其混匀。再加入乙腈6mL，使用涡旋（10000r/min）混匀5min，然后再用4000r/min的速度离心5min，准确移取上清液1.0mL至另一5mL离心管。加入混合净化剂（250mgNa2SO4+50mgC18+50mgNH2），涡旋30s，然后用15000r/min的速度离心10min。准确移取0.3mL上清液，加入0.7mL水进行稀释，混合均匀之后用0.22μm 有机微孔滤膜进行过滤，用LC-MS/MS测定滤液。

表1 22种兽药的质谱采集参数、定量限及相关系数

1.4 仪器分析条件

液相条件：流速：0.3mL/min；色谱柱：ZORBAX C18 (2.1mm850mm，1.8μm)，流动相A：0.1%（v/v)甲酸-水，流动相B：0.1%（v/v)甲酸-乙腈；梯度洗脱：0～1min，5%B；1～3min，5%B～55%B；3～6min，55%B～75%B；6～6.5min，75%B～95%B；6.5～7.0min，95%B；7.0～7.01min，95%B～5%B；7.01～10min，5%B。柱温：35℃，进样量：5μL。

质谱条件：多反应检测模式（MRM）；电喷雾离子（ESI）源；正离子扫描；干燥气流速5L/min，干燥气温度350℃，毛细管电压4000V，喷雾器温度压力45psi；多反应检测（MRM）离子对，质谱采集参数和保留时间见表1。其中，以两对MRM离子对和化合物的色谱保留时间进行定性，定量MRM 离子对的峰面积。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理过程的确定

在质谱MRM模式下，样品基质的杂质对测定的干扰较小，而且色谱柱具有一定的分离净化功能，可以保障极性较强的杂质在1min之前在质谱仪之外被洗脱，因此在实验设计时，考虑采用较为经济、简单的液-液分配方法对样品进行前处理。

2.1.1 提取液的选择

根据参考文献[7-9]设定样品前处理条件，本文分别考察了以2%（v/v)甲酸-乙腈、甲醇、乙腈，0.1moL/L的Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液-乙腈溶液提取作为提取液的提取效果，有机溶剂如乙腈、甲醇具有良好的沉淀蛋白质和提取目标化合物的能力，但是使用甲醇会将极性基质干扰物更多的带入，增加后续净化的难度。用乙腈、2%（v/v)甲酸-乙腈进行提取，可以有效将大部分化合物提取出去，但四环素类化合物回收率仅20%～30%，在0.1moL/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液-乙腈混合溶液提取时，6类兽药的回收率都能满足要。经过反复实验摸索，本研究最终确定称样2.00g时，加50L0.1moL/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，涡旋混合30S，然后加6mL乙腈涡旋提取。

2.1.2 净化条件的优化

通过对中性氧化铝、NH2、C18和PSA这4种吸附剂对比，PSA和中性氧化铝对四环素类、喹诺酮类化合物均有不用程度的吸附效果，但净化性能较差，干扰峰多；C18和NH2这两种吸附剂的净化效果相差不大，协同使用净化效果比较理想。试验通过协同使用和单独使用C18和NH2这两种吸附剂，比较不同的用量（50、100、200mg）下的净化效果，结果表明：使用50mgNH2与50mgC18的组合能够起到良好的净化效果，且不会对待测物产生明显的吸附。因此，本研究确定C18和NH2的用量为50mg。

无水MgSO4与无水Na2SO4一般作为QuEChERS方法常用的脱水剂，本试验将无水MgSO4加入提取液中，结果证实喹诺酮类和四环素类的回收率在一定程度上有所降低，特别是四环素类的回收率有非常明显的下降，而无水Na2SO4影响不明显。原因在于四环素类药物容易和Mg2+产生化学反应形成螯合物。经过反复多次试验，发现无水Na2SO4的加入量在250mg时试验效果最佳。

2.2 色谱条件优化

本研究的有机相采用乙腈，试验考察了水相中，添加5mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸对质谱灵敏度与色谱分离的影响。试验结果证明：添加乙酸铵后，四环素类峰形效果较差，且灵敏度下降比较明显；添加甲酸后，各目标化合物具有了更高效的离子化效率，峰形明显改善，灵敏度普遍较好。

将0.1%的甲酸加入乙腈中，各化合物具有更强的响应信号，重复性和分离度效果更加良好，并且明显降低了基线噪音。因此，本试验最终的流动相选取的是：0.1%甲酸-乙腈-0.1%甲酸水溶液。运用选定的色谱柱和流动相，对洗脱程序进行有效梯度优化，将所有检测物的灵敏度和峰形调整到最佳。

2.3 方法线性范围、定量限和加标回收

本研究为了有效消除标准曲线的基质效应，应用基质空白溶液配制。绘制标准曲线：横坐标为各组分的质量浓度，纵坐标为各色谱峰面积，相关系数见表1。各个质量浓度范围内，质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系（关系数为0.992～0.999）。定量限：信噪比≥10，22种兽药的定量限为4～25μg/kg。

选取样品为阴性猪肉，添加标准溶液时按1、2、10倍检出限的水平浓度进行，一式3份，涡旋1min，然后静置30min，之后按照“1.3”的步骤方法进行处理，按照“1.4”的色谱条件进行进样，通过各组的峰面积对加标回收率进行计算，结果22种化合物3各不同浓度添加水平，回收率在65%～105%之间，相对标准偏差均小于10%，整体回收率水平符合食品检测的要求。

3 结论

本研究采用改进的QuEChERS方法建立了LC-MS/M S同时测定猪肉中硝基咪唑类、四环素类、β-内酰胺类、糖皮质类激素、大环内酯类和喹诺酮类6类22种兽药的多残留快速分析方法。分别对提取溶液、净化方法、吸附剂的选择、色谱条件进行了优化，与行业标准和国家现行的标准作比较，该方法有效节约了检测的成本、缩短了检测时间周期。本方法监测快速、操作简单、净化效果好，回收率和灵敏度等符合多残留检测技术的要求。为各食品检测机构提供了快速、简单的筛查方法，在日常对猪肉的禁限用兽药监控中可以大批量的有效监测。