龙胆泻肝汤抑制葡萄膜炎大鼠Notch信号通路活化的作用△

殷学伟 刘滨 魏慧霞 唐凯 毕宏生 郭大东

葡萄膜炎是一类临床常见、反复发作的自身免疫性眼病，可造成眼组织不可逆性损害。辅助性T细胞17(T helper 17，Th17)和调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是近年来研究人员发现的CD4+T淋巴细胞亚群，其中Th17细胞介导免疫应答，而Treg细胞介导免疫抑制，二者在功能上互相拮抗[1]。在葡萄膜炎的发生发展过程中，Th17和Treg细胞发挥了重要作用。Notch信号通路是调节炎症反应和自身免疫性疾病、维持机体免疫平衡的重要信号通路，可通过调控naïve CD4+T 细胞向Th17、Treg细胞的分化而影响Th细胞的比例平衡[2]。有研究发现，龙胆泻肝汤(Longdan Xiegan Decoction，LXD)具有较强的免疫调节作用，对前葡萄膜炎有较好的治疗效果[3]。动物实验表明，LXD可有效减少实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠前房炎症细胞浸润，促进机体免疫功能恢复[4]，但是LXD对Notch信号通路的调控以及对Th细胞分化的影响尚未完全清楚。本研究拟通过检测LXD对EAU大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1、DLL4、白细胞介素10(interleukin 10，IL-10)、IL-17基因和蛋白的表达变化，探讨LXD在葡萄膜炎发病过程中对Notch信号通路的调控及对Th17/Treg细胞比例平衡影响的作用，初步阐释LXD治疗葡萄膜炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料LXD配方颗粒(产品批号：1311007W，华润三九医药股份有限公司)；FITC-CD4、PE-CD8、PE-IL-17、APC-CD25、 PE-Foxp3(eBioscience公司，美国)；固定破膜试剂盒(BD公司，美国)；miRNA组织/细胞快速提取试剂盒(艾德莱生物科技有限公司，北京)；cDNA逆转录试剂盒、2×SYBR Green I试剂盒(QIAGEN公司，德国)；β-巯基乙醇、谷氨酰胺(Amresco公司，美国)；胎牛血清、1640培养液(HyClone公司，美国)；淋巴细胞分离液(Solarbio公司，北京)；大鼠Notch1、DLL4、IL-10、IL-17蛋白ELISA试剂盒(基因美生物科技有限公司，武汉)。

1.2 实验动物分组及处理选取45只6～8周龄成年健康Lewis雌性大鼠(体质量160～180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，随机将其分为正常对照组(NC组，n=15)、EAU模型组(n=15)和LXD干预组(n=15)。其中EAU模型组和LXD干预组大鼠在后肢足垫、腹壁两侧和后背皮下各点一次性注射200 μL含光感受器间维生素A结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP)、完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)和结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，TB)H37RA混合的乳糜液以诱导EAU，而NC组大鼠在相同部位注射等量不含IRBP的乳糜液。LXD干预组大鼠诱导EAU后每天给予LXD 1000 mg·kg-1(大鼠使用剂量为临床等效剂量折算的5倍)灌胃处理，每天1次，直至大鼠处死。免疫后12 d收集各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织，流式细胞仪检测各组织分离的T淋巴细胞中Th17、Treg细胞的表达水平，分析Th17/Treg比例的变化情况，实时荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,QT-PCR)检测Notch1、DLL4、IL-10和IL-17 mRNA在脾脏、淋巴结及眼组织中的表达；ELISA检测其相应的蛋白表达水平。

1.3 眼底炎症表现及组织病理学检查免疫后12 d，各组随机选择3只大鼠，Genesis-D眼部照相机观察三组大鼠眼底炎症表现，腹腔注射100 g·L-1水合氯醛麻醉法处死，摘除同侧眼球，立即置于眼球固定液中固定24 h，之后眼球标本脱水、包埋、切片，行HE染色，观察睫状体和视网膜病理学变化。

1.4 QT-PCR检测Notch1、DLL4、IL-10及IL-17 mRNA的表达水平三组大鼠随机各取6只，无菌条件下分离脾脏、淋巴结和眼组织，每只大鼠各取部分组织冻存于-80 ℃冰箱中用于ELISA检测，其余样品用Trizol法在液氮中研磨后分别提取总RNA，超微量分光光度计(K5600，北京凯奥科技发展有限公司)检测RNA的纯度和浓度 (A260/A280为1.8～2.1)。用cDNA反转录试剂盒分别将提取的总RNA反转录成cDNA，Q-PCR检测Notch1、DLL4、IL-10和IL-17基因的表达(反应体系为20 μL，每个基因设3个复孔)，GAPDH为Notch1、DLL4、IL-10和IL-17基因的内参。引物序列分别为：GAPDH：上游引物：5’-GACCACAGTCCATGACATCACT-3’，下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’；Notch1：上游引物：5’-ATGGCCCCACCTGCAGACAAGATG-3’，下游引物：5’-GGCACGGCAGGCACAGCGATAG-3’；DLL4：上游引物：5’-CAAGAATAGCGGCAGTGGTCGTAA-3’，下游引物：5’-GTAGCGCAGTCTTGTGAGGGTGTT-3’；IL-10：上游引物：5’-TTCCATCCGGGGTGACAATAA-3’，下游引物：5’-TTCTGGGCCATGGTTCTCTGC-3’；IL-17：上游引物：5’-TTGCTGCTACTGAACCTGGAG-3’，下游引物：5’-GCATGGCGGACAATAGAG-3’。LightCycler®480Q-PCR仪(Roche公司，美国)检测大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1、DLL4、IL-10和IL-17基因表达水平的变化。Q-PCR反应条件为：94 ℃ 5 s，循环1次；94 ℃5 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，反应循环45次。Q-PCR检测结束后，按照 2-ΔΔCt计算Notch1、DLL4、IL-10和IL-17基因表达情况，并进行数据统计分析。

1.5 ELISA检测Notch1、DLL4、IL-10和IL-17蛋白的表达变化用液氮分别将各组大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织研磨至细粉状，加入350 μL RIPA裂解液溶解后电动匀浆30 s，将样品置于冰上，然后超声波细胞粉碎机冰超声20 min，8000 r·min-1、4 ℃离心20 min。离心后样品去沉淀，将上清转移至新的EP管中，各样品按照ELISA试剂盒说明书的要求进行操作，使用多功能酶标仪(Perkin-Elmer公司，美国)检测各组样品的吸光度(A)值，通过用标准曲线法计算各组样品中Notch1、DLL4、IL-10和IL-17蛋白的表达。

1.6 流式细胞仪检测Th17、Treg细胞水平分别取三组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织，研磨后通过细胞筛进行细胞初滤，然后通过尼龙毛过滤收集总T淋巴细胞。-80 ℃冰箱取出cocktail细胞刺激液，37 ℃ 水浴解冻。加入6 μL的cocktail刺激液和4 μL的Golgistop蛋白转运抑制剂，移液器轻轻吹打混匀。用锡箔纸将EP管严密包裹避光，放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育5 h；孵育后首先进行细胞表面染色，然后用破膜溶液对细胞固定破膜后再进行胞内染色。染色结束后滤网过滤，流式细胞仪检测各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Th17、Treg细胞表达水平。

2 结果

2.1 大鼠眼部炎症表现及组织病理学变化通过Genesis-D眼部照相机观察发现，NC组大鼠眼部未见虹膜血管扩张充血；EAU模型组大鼠免疫后12 d眼部炎症严重，表现为虹膜严重扩张充血，前房大量纤维蛋白渗出、粘连，瞳孔膜闭，积脓等症状(图1)。根据临床表现记录进行炎症评分，EAU模型组大鼠炎症评分为(3.30±0.52)分，LXD干预组大鼠炎症评分为(2.09±0.33)分，炎症明显轻于EAU模型组(P<0.05)，仅表现为轻度虹膜血管充血。组织病理学检查结果显示，NC组大鼠眼部组织结构清晰，无炎性细胞浸润；EAU模型组大鼠睫状体和视网膜内可见大量炎性细胞浸润，眼组织结构紊乱、视网膜全层破坏；LXD干预组大鼠睫状体和视网膜仅表现为轻、中度炎性细胞浸润。

图1 免疫后12 d各组大鼠眼部炎症情况。A：NC组；B：EAU模型组；C：LXD干预组

2.2 QT-PCR检测Notch1、DLL4、 IL-10及IL-17 mRNA表达水平Q-PCR检测结果显示，与NC组相比，EAU模型组大鼠各组织中Notch1、DLL4、IL-10及IL-17 mRNA表达水平均明显升高(均为P<0.05)；LXD干预组大鼠各组织中Notch1、DLL4及IL-17 mRNA的表达较NC组升高，但明显低于EAU模型组，且其IL-10 mRNA表达水平高于EAU模型组(图2)。

图2 Notch1、DLL4 、IL-10、IL-17 mRNA 在NC组、EAU模型组和LXD干预组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织的表达水平。A：Notch1 mRNA表达水平；B：DLL4 mRNA表达水平；C：IL-10 mRNA表达水平；D：IL-17 mRNA表达水平。与NC组比较，*P<0.05；与EAU模型组比较，#P<0.05

2.3 ELISA检测Notch1、DLL4、 IL-10及IL-17蛋白表达水平ELISA检测结果显示，EAU模型组和LXD干预组大鼠免疫后脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1、DLL4、IL-10及IL-17的蛋白表达水平趋势与mRNA基本一致。与NC组大鼠相比，EAU模型组大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1、DLL4 、IL-10及IL-17蛋白表达水平均明显升高(均为P<0.05)；LXD干预组大鼠各组织中Notch1、DLL4及IL-17蛋白的表达较NC组升高，但明显低于EAU模型组，且其IL-10蛋白表达水平高于EAU模型组(图3)。

图3 Notch1、DLL4 、IL-10、IL-17蛋白在NC组、EAU模型组和LXD干预组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织的表达水平。A：Notch1蛋白表达水平；B：DLL4 蛋白表达水平；C：IL-10 蛋白表达水平；D：IL-17 蛋白表达水平。与NC组比较，*P<0.05；与EAU模型组比较，#P<0.05

2.4 流式细胞仪检测Th17、Treg细胞表达水平流式细胞仪分别检测各组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Th17、Treg细胞的表达水平发现，与NC组的Th17、Treg细胞水平相比，免疫后EAU模型组大鼠中Th17/Treg比例显著增高、呈现不平衡表达(均为P<0.05)；经过LXD干预后，LXD干预组大鼠的Th17细胞表达水平明显降低，Treg细胞表达水平显著升高，Th17/Treg比例趋向于平衡(均为P<0.05)，见图4。

图4 流式细胞仪检测免疫后12 d NC组、EAU模型组和LXD干预组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Th17/Treg细胞比例变化。与NC组比较，*P<0.05；与EAU模型组比较，#P<0.05

3 讨论

Notch 信号通路是调节炎症反应和自身免疫性疾病的重要通路，可通过调控naïve CD4+T 细胞的分化而影响T辅助(Th)细胞的比例平衡发挥作用[2]。Treg细胞数量减少或功能紊乱、Th17/Treg细胞比例失衡均可导致葡萄膜炎的发生[5-6]。因此，Th17/Treg细胞比例异常在EAU发病过程中发挥重要作用。临床研究证实，葡萄膜炎患者发病过程中Th17/Treg细胞的表达呈不平衡状态，Th17细胞比例及相关细胞因子的水平在葡萄膜炎患者活动期均升高，而Treg细胞比例及相关细胞因子的水平均下降[7]。LXD可有效缓解EAU大鼠的前房炎症，减少炎性细胞浸润，保护眼组织超微结构的完整性，降低TNF-α等炎性因子的表达水平，调节免疫状态，促进机体免疫功能恢复，有效维持眼局部免疫平衡，对EAU发挥一定的治疗作用[8]。本研究结果发现，与NC组相比，免疫后12 d EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结、眼组织中Notch1、DLL4 、IL-10及IL-17 mRNA和蛋白表达水平均明显升高，Th17/Treg细胞比例明显失衡，提示Notch信号通路活化可能在葡萄膜炎病理机制中发挥作用；LXD可明显降低EAU大鼠组织中Notch1、DLL4及IL-17的mRNA和蛋白表达水平，减轻Th17/Treg细胞比例失衡，提示LXD可能通过抑制Notch信号通路活化、调控naïve CD4+T 细胞向Th17、Treg细胞分化、均衡Th17/Treg 细胞比例，进而发挥治疗葡萄膜炎的作用，其作用机制可能与LXD干预Notch信号通路调节的naïve CD4+T细胞向Th17和Treg细胞的分化有关[9]。

EAU小鼠眼组织可表达Notch 1、Notch 2、Jag1和DLL4，Notch信号通过负调控EAU小鼠组织中Treg细胞的免疫功能加重EAU的发展[10]。药理学研究表明，LXD能调节机体免疫功能，对淋巴细胞及非特异性免疫功能均有一定的正向调节作用。白桦等[11]研究发现，LXD对带状疱疹患者的外周血中Th17细胞的表达具有显著抑制作用，提高患者免疫功能的恢复；有研究证实，LXD可通过多种途径在EAU的治疗中发挥免疫调节作用，促进机体免疫功能的恢复[12]。本研究结果表明，LXD可通过下调EAU大鼠眼组织、脾脏和淋巴结中Notch 信号通路中Notch1 和 DLL4 分子的表达、抑制Notch信号通路的活化，进而减少naïve CD4+T 细胞向Th17 细胞的定向分化，纠正Th17/Treg细胞比例失衡、促进全身和眼内免疫环境“双平衡”，从而达到治疗葡萄膜炎的目的。

总之，LXD可显著抑制Notch信号通路的活化、改善Th17/Treg细胞比例平衡，从而有助于机体免疫功能的恢复，减轻EAU大鼠的炎症表现。本研究为临床应用LXD治疗葡萄膜炎提供了新的理论依据，但其发挥作用的具体机制还需要进一步研究证实。