自拟中药复方金芩蓝口服液对靶动物临床试验效果的研究报告

任丽花，杨国辉，王德功，刘 冬，张沛，李卓伟，吕 让

（河北远征药业有限公司，河北省兽药工程技术研究中心，河北石家庄050041）

1 前言

鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis，ILT）是鸡的一种接触性呼吸道传染病，可引起死淘率增加、产蛋率大幅下降、畸形蛋白蛋增多，并易继发感染多种细菌性、病毒性疾病，而造成严重的经济损失。严重感染时病鸡张口伸脖呼吸、明显喘气、咳嗽、甩鼻、咳出血样黏液，此后死亡率大幅升高。在养殖密集地区，非典型感染日渐增多，呈现慢性消瘦、低死亡率感染，主要表现为鼻窦炎、结膜炎和黏液性气管炎。我国自50年代以来大部分地区有不断发生的报道，多呈地方流行性，并且近年来发病的日龄有明显提前的趋势。最早发病可见20～40日龄，给养鸡业造成严重的经济损失，是集约化养鸡场的重要疫病之一[1]。

对于本病的治疗，目前尚无化学特效药，主要是用高免血清、高免卵黄抗体和中药复方制剂进行治疗。《中国兽药典》收载的喉炎净散和临床应用的喉瘟散、鸡喉净等对治疗ILT 有较好的疗效。中兽药是在中兽医理论指导之下用于防治动物疾病的药物，因其天然性、多能性、低毒副作用、不易产生有害物质残留和不易产生耐药性等优点，为动物临床所广泛应用。本实验所采用的金芩蓝口服液是本单位联合相关单位研发的纯中药制剂，由金银花、黄芩、连翘、板蓝根四味中药组成，1mL 含原生药1.25g，临床拟用于治疗鸡传染性喉气管炎引起的发热、咳嗽、咽喉肿痛。

2 试验方法

2.1 材料

2.1.1 试验药品和试剂

受试兽药：金芩蓝口服液。[规格]100mL，1mL 相当于原生药1.25g；[主要成分]金银花、黄芩、连翘、板蓝根；[功能]清热解毒，消肿利咽；[主治]鸡传染性喉气管炎引起的发热、咳嗽、咽喉肿痛。河北远征药业有限公司生产，批号：170702。

对照兽药：喉炎净散。标准《中国兽药典二部（2015年版）》；[规格]250g；[主要成分]板蓝根、蟾酥、人工牛黄、胆膏、甘草等；[功能]清热解毒、通利咽喉；[主治] 鸡喉气管炎；[用法与用量] 鸡0.05～0.15g，拌料；广东高山动物药业有限公司生产，批号2017061702。

病毒基因组DNA 提取试剂盒及PCR 试剂盒均购自天根科技生化有限公司。

2.1.2 种毒和试验动物

ILTV 王岗株，购自中国兽医药品监察所，批号：AV195；SPF 种蛋，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

试验鸡为80日龄未接种过ILT 疫苗的海兰灰蛋鸡（♀），平均体重约1kg/ 只，购自保定市清苑区华丰养殖场。攻毒试验鸡饲养于动物房。室内使用三层阶梯式育成鸡笼架，每笼10 只鸡。自动饮水系统，人工给料。饲养温度为18～28℃，相对湿度为50～60%，使用产蛋后备鸡饲料（山西晋龙集团太原饲料有限公司）。试验前鸡群喉拭子PCR 检测ILTV 阴性。阴性对照组的健康试验鸡饲养于动物房内（与攻毒试验鸡距离1500 米），养殖单元信息同攻毒试验鸡。两个养殖场所的工作人员无交叉流动。

2.1.3 主要仪器设备微电脑全自动孵化机（FT-XF4）：北京春明方通电子有限公司；PCR 仪（AB2700）：美国应用生物系统中国公司；凝胶成像分析仪（WD-9413A）：北京六一仪器厂；KD2508 轮转式切片机：浙江金华科迪仪器设备有限公司。

2.2 方法

2.2.1 ILT 病例诊断标准

经查阅国内外文献，未发现有关ILT 的疾病详细诊断标准，本次试验根据ILT 病鸡临床发病特点及分子生物学诊断方法，自行制订本试验病例诊断标准为：具有ILT 典型临床症状（咳嗽、呼吸罗音、发热、喉头肿胀、甩鼻、鼻部有分泌物）和特征性剖检病变（喉和气管粘膜肿胀、出血、有分泌物）且喉拭子PCR 检测ILTV 为阳性。

2.2.2 ILT 病例纳入标准

对人工造模并确诊发病试验鸡ILT 典型临床症状进行打分评估，包括咳嗽次数、罗音次数、体温升高程度和喉头肿胀程度，评分标准见表1。经统计发现各项症状得分为1 分和2 分的病鸡数量最多，达到88%，故制定本试验病例纳入标准为：各项症状得分为1 分或2 分的病例，可用于金芩蓝口服液治疗ILT 的实验性临床试验。

表1 ILT 病例纳入评分标准

明显 严重且2出血 3

2.2.3 金芩蓝口服液治疗ILT 使用剂量和疗程依据

根据药效学试验结果，小鼠的金芩蓝口服液用药剂量为2mL/kg?BW。小鼠标准体重按0.02kg计算，每只小鼠用药量应为0.04mL。根据体表面积比率换算等效剂量法（人对小鼠的等效剂量比值为387.9），计算人用剂量应为0.04mL*387.9=15.52mL。按照临床经验1 个成人相当于40 只鸡，鸡用药量应为15.52mL/40=0.39mL/只。每只成年鸡饮水量约0.2L，鸡的饮水给药剂量应为0.39mL/0.2L=1.93mL/L，本试验设置金芩蓝口服液中剂量为饮水中添加2.0mL/L。故确定复方芩兰口服液3 个试验组的给药方案为：在饮水中分别按高、中、低三个剂量（4.0 mL/L、2.0 mL/L、1.0 mL/L）添加金芩蓝口服液。

参考临床治疗鸡病常用中药用药疗程并经药效学试验验证，金芩蓝口服液连续用药5 天可以有效治疗动物呼吸道炎性病症，故设置金芩蓝口服液临床用药疗程为5 天。

药物对照组喉炎净散根据 《中国兽药典》规定用量为0.05～0.15g，本试验选取中间剂量0.1g。确定药物对照组的给药方案为：每只鸡每天0.1g，拌料添加，连续用药5 天。

2.2.4 ILT 病例模型的建立

ILTV 种毒复壮：将ILTV 种毒灭菌生理盐水稀释，经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF 鸡胚，38℃孵化，72h 后无菌收集尿囊液及病变尿囊膜，组织研磨器充分研磨，-20℃反复冻融，使病毒粒子从组织细胞中充分释放出来，离心取上清液，作传代接种。按上述方法传至第4 代处理后作为病毒感染液备用，Reed-Muech 氏法计算ILTV 的EID50。

建立病例模型：选健康试验鸡150 只，采用滴鼻方式人工接种ILTV 0.2 mL（100×EID50）/只，同时鸡舍洒水并电扇吹风造成冷应激。攻毒72h 后，观察记录鸡群临床症状表现，取10 只剖检观察呼吸道病变，所有试验鸡采集喉部分泌物进行PCR 检测，依据病例诊断标准进行发病诊断。另选20 只健康试验鸡作为阴性对照组，由专人饲养于动物房内。

2.2.5 PCR 检测

PCR 检测用于种毒鉴定和试验鸡发病诊断。试验鸡棉拭子采集喉部分泌物，提取病毒DNA，PCR 扩增ILTV 的TK 基因。TK 基因引物P1：5′- ACG ATG ACT CCG ACT TTC-3′，P2：5′-CGT TGG AGG TAG GTG GTA-3′，由TaKaRa 公司合成，产物大小为643 bp。扩增体系：5μL10×buffer、4μLdNTP、上下游引物（25pmol/μL）各1μL，模板DNA4μL、TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.5μL、加水将体积补足至50 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，51℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环30 次；最后72℃延伸5 min，之后4℃保存。反应结束后，取5μLPCR 产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，于凝胶成像仪中观察、照相。

2.2.6 试验病例诊断和筛选纳入

病例诊断：攻毒72h 后，试验鸡表现出一系列临床症状，包括咳嗽，呼吸有罗音，不同程度发热，鼻部有分泌物，经常甩鼻，喉头肿胀。剖检病鸡可见喉和气管粘膜肿胀、出血，表面覆盖分泌物。实验室分子生物学检测PCR 试验，ILTV 核酸均为阳性。根据本试验病例诊断标准，判定本试验鸡群发生了ILT。

病例筛选纳入：依据本试验病例纳入标准，在受试鸡群中选择同时符合咳嗽为每分钟1-2次、罗音为每分钟1-4 次、体温为41.6-42.5℃、喉头有可见肿胀（即各项症状得分为1 分或2 分）的病鸡100 只，用于金芩蓝口服液治疗ILT 的临床试验。

2.2.7 金芩蓝口服液治疗ILT 试验

2.2.7.1 试验动物编号和随机分组方法

试验鸡编号：在确诊病例中依据病例纳入标准筛选出100 只试验鸡，制备脚环确定初始编号。方法为取2cm×3cm 纸片100 张，按1、2、3……顺序填写数字，覆以透明胶带，依照每笼取出顺序分别环绕粘贴在试验鸡鸡脚上。20 只阴性对照组健康鸡同法编号。

试验病鸡随机分组：将100 只试验病鸡初始编号录入计算机Excel 文件中，赋予随机数字，并按照随机数字由小到大顺序对初始编号排序，排序后第1～20 个编号为第1 组，第21～40 个编号为第2 组，以此类推，分出5 组。依照随机分组顺序将试验鸡归笼，每笼10 只，每2 笼为1 组。1～5组分别对应为金芩蓝口服液高、中、低剂量组，药物对照组和阳性对照组。分组信息由试验设计人员和饲养管理人员掌握，试验设计人员和饲养管理人员不参与试验鸡的症状、剖检的观察和评分。

2.2.7.2 试验动物处理

金芩蓝口服液的3 个试验组在饮水中分别按高、中、低三个剂量（4.0 mL/L、2.0 mL/L、1.0 mL/L）添加金芩蓝口服液，全天自由饮用。药物对照组在饲料中按0.1g/天/只剂量添加喉炎净散，阳性对照组不给药，阴性对照组试验鸡正常饲养。用药组连续用药5 天，用药结束后观察5 天。试验期间记录各组鸡的死亡情况，试验结束后根据临床症状和剖检病变评分标准予以打分，采集喉部组织常规法制备切片、HE 染色、镜下观察并拍照，依据疗效判定标准统计各组的治疗有效率、治愈率和死亡率。见表2。

表2 试验动物分组与处理

2.2.8 金芩蓝口服液治疗ILT 疗效判定标准

（1）死亡率：试验期间死亡（排除饲养管理等意外因素），剖检喉和气管具有ILT 特征性病变者判定为ILT 死亡病例。死亡鸡数占每组试验鸡数的百分率为死亡率。

（2）有效率：试验结束后，临床症状有所减轻者判定为有效病例。有效鸡数占每组试验鸡数的百分率为有效率。

（3）治愈率：试验结束后，临床症状完全消失、剖检喉和气管无ILT 特征性病变者判定为治愈病例。治愈鸡数占每组试验鸡数的百分率为治愈率。

（4）用药后临床症状及剖检病变评分标准见表3。

表3 用药后ILT 病例临床症状及剖检病变评分标准

2.3 数据统计分析

应用SPSS17.0（单因素方差分析和卡方检验）对试验数据进行统计分析。

3 结果

3.1 人工诱发ILT 病例模型试验

用于ILTV 种毒增殖的鸡胚尿囊膜增厚且出现痘斑，胚体有出血，四代病毒液经PCR 扩增呈阳性。Reed-Muech氏法计算ILTV 的EID50为10-4.81/0.2mL。

阴性对照组鸡正常生长，无病征和死亡，喉拭子PCR 扩增ILTV 呈阴性。人工接种ILTV 的鸡群在攻毒72h 后，陆续出现症状，包括采食减少，体温升高，缩头闭眼，颈部羽毛逆立。病鸡经常咳嗽，有鼻液，张口呼吸，有湿性罗音，喉部红肿，有的眼睑肿胀。剖检具有典型临床症状的病鸡，可见喉头和气管粘膜肿胀，有明显出血点，气管内壁覆盖带血的黏液性分泌物，个别鸡肺脏有出血点。采集喉部分泌物PCR 扩增ILTV 均呈阳性。依据ILT 病例诊断标准进行判定，150 只鸡全部发病，发病率为100%。

3.2 金芩蓝口服液对ILT 病鸡临床症状的影响

统计结果可见，各组鸡症状评分在试验开始时组间差异不显著。经用药治疗后各组鸡临床症状均有所减轻。至试验结束时，金芩蓝口服液高、中剂量组所有症状和剖检评分与阳性对照组比较差异极显著（P＜0.01），且均低于金芩蓝口服液低剂量组和药物对照组，高、中剂量两组间差异不显著（P＞0.05）。各组鸡症状及剖检评分见表4。

表4 人工感染ILT 病鸡临床症状及剖检病变评分(n=20)

3.3 金芩蓝口服液对ILT病鸡喉部组织病变的影响

组织切片镜下观察可见，阴性对照组喉部黏膜表面纤毛整齐，黏膜层腺体结构完整；阳性对照组喉部黏膜表面纤毛脱落，黏膜层细胞排布杂乱、松散，腺体结构破坏甚至消失；各用药组与阳性对照组比较，组织病变较轻，结构基本正常，有部分炎性细胞浸润。

3.4 金芩蓝口服液对ILT 病鸡的治疗效果

经比较可见，用药治疗后病鸡死亡情况得到控制，各用药组死亡率均明显低于阳性对照组，其中金芩蓝口服液高剂量组与阳性对照组比较差异显著（P＜0.05）。金芩蓝口服液高剂量组治疗有效率达到100%，治愈率为90%，中剂量组有效率为95%，治愈率为80%，均高于低剂量组和药物对照组，且高、中剂量两组间差异不显著（P＞0.05）。证明金芩蓝口服液按高剂量（4.0mL/L）、中剂量（2.0mL/L）给药，对ILT 病鸡的治疗效果优于喉炎净散。阳性对照组病鸡在试验结束时，有个别自愈，但自愈率极低，与所有用药组比较差异极显著（P＜0.01）。各组治疗效果见表5。

表5 金芩蓝口服液对ILT 病鸡的治疗效果（n=20）

4 讨论和结论

本试验通过人工接种ILTV 结合冷应激的方法，导致试验鸡在染毒72h 后出现ILT 典型临床症状和特征性剖检病变，喉拭子PCR 检测ILTV为阳性，隔离饲养的阴性对照组鸡正常生长无病征和死亡，证明本次试验成功制造了ILT 病例模型，发病率为100%。依据病例纳入评分标准对确诊病鸡进行症状评分，考虑到避免单项指标过轻或过重病例无法客观的反应药效，故而选择每项症状得分为1 分或2 分的试验鸡进行复方芩兰口服液的实验性临床试验。采用随机方法分组后经统计各组鸡症状评分差异不显著，保证了本次试验各组纳入病例品种、年龄、病期相同，病程、体质相近，符合农业部对兽用中药、天然药物临床试验的样本纳入要求，从而确保本试验的数据和结果科学可信。

本试验中使用金芩蓝口服液按高、中、低三种剂量治疗人工感染ILT 病鸡，各组的临床症状和剖检病变均有所改善。比较各组的疗效指标，金芩蓝口服液高、中、低剂量组有效率分别为100%、95%和90%，治愈率分别为90%、80%和60%，药物对照组有效率为90% ，治愈率为75%，金芩蓝口服液高、中剂量组治疗效果优于低剂量组和药物对照组。本试验证实金芩蓝口服液对ILT 症候有显著的治疗作用，鸡饮服本药的最适治疗浓度为2mL/L～4mL/L。因此，金芩蓝口服液有效减轻ILT 病鸡的临床症状和组织病变，降低死亡率，可用于鸡传染性喉气管炎引起的发热、咳嗽、咽喉肿痛，且综合考虑临床用药效果推荐用法用量为：鸡，2mL/L 混饮，连用5 天。