稳定过表达IL-9的小鼠CT-26肿瘤细胞株及BALB/C小鼠皮下移植瘤模型的建立

王进 董晓强 赵鑫 朱新国 赵华 张江磊

【摘要】目的 建立穩定过表达IL-9的小鼠CT-26肿瘤细胞株及BALB/C小鼠皮下移植瘤模型，为后续研究IL-9在结肠癌肿瘤微环境中的作用及其机制提供实验基础。方法 将目的基因IL-9片段插入带有绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体GV492，构建重组过表达IL-9-GV492质粒，转染293T细胞后，用倒置荧光显微镜观察GFP的表达强度，用蛋白免疫印迹法检测IL-9的表达;包装病毒后检测病毒滴度。将过表达IL-9的慢病毒转染小鼠结肠癌CT-26细胞后，用倒置荧光显微镜观察GFP的表达强度，用流式细胞仪检测GFP及IL-9的表达，用qRT-PCR法检测IL-9的mRNA表达。过表达IL-9的CT-26细胞皮下接种BALB/C小鼠建立皮下移植瘤模型后，用免疫组化法检测肿瘤中IL-9的蛋白表达，用qRT-PCR法检测IL-9的mRNA表达。结果 阳性重组质粒PCR扩增产物大小约617 bp，DNA测序显示重组质粒的编码序列与目标序列完全一致。293T细胞自身不表达IL-9，重组质粒转染293T细胞后表达IL-9;慢病毒滴度为2×109 TU/ml。慢病毒转染小鼠结肠癌CT-26细胞后，Control组、LV-NC组、LV-IL-9组GFP表达阳性率分别为0、96.4%、91.2%;LV-IL-9组IL-9的MFI及mRNA的表达均高于LV-NC组（P均< 0.05）。BALB/C小鼠皮下移植瘤模型建立后，实验组小鼠肿瘤IL-9的阳性表达率及mRNA的表达均高于阴性对照组（P均< 0.05）。结论 稳定过表达IL-9的小鼠结肠癌CT-26细胞株及BALB/C小鼠皮下移植瘤模型建立成功。

【关键词】慢病毒转染;IL-9基因;CT-26肿瘤细胞;BALB/C小鼠;异种移植瘤模型

【Abstract】Objective To construct the CT-26 cell lines stably over-expressing IL-9 gene and establish the BALB/C mouse models with subcutaneous xenograft， aiming to provide experimental basis for further study of the function and mechanism of IL-9 in the tumor microenvironment of colon cancer.  Methods The IL-9 gene fragment was inserted into the lentiviral plasmid GV492 which carried green fluorescent protein （GFP） to establish the recombinant IL-9-GV492. After the 293T cells were transfected， the expression intensity of GFP was observed under an inverted fluorescence microscope and the expression level of IL-9 was measured by Western blot. The virus titer was detected after packaging the lentiviral vectors. After the lentivirus over-expressing IL-9 were transfected with the CT-26 cells， the expression intensity of GFP was observed under an inverted fluorescence microscope. The expression levels of GFP and IL-9 were measured by flow cytometry. The expression level of IL-9 mRNA was measured by qRT-PCR. The BALB/C mouse models with subcutaneous xenograft were established by subcutaneous inoculation of IL-9-CT-26 cells. The expression level of IL-9 protein in the tumors was detected immunohistochemistry， and the expression level of IL-9 mRNA was measured by qRT-PCR. Results The PCR amplified product of positive recombinant plasmid was approximately 617 bp in size. DNA sequencing demonstrated that the coding sequence of the recombinant plasmid was completely consistent with the designed sequence. The 293T cells didnt express IL-9， whereas expressed IL-9 after the cells were transfected with the recombinant plasmid. The virus titer of the packaged lentivirus was 2×109 TU/ml. After the CT-26 cells were transfected with the lentivirus over-expressing IL-9， the positive expression rates of GFP in the control， LV-NC and LV-IL-9 groups were 0， 96.4% and 91.2%， respectively. The IL-9 expression （MFI） and IL-9 mRNA in the LV-IL-9 group were significantly higher than those in the LV-NC group（all P < 0.05）. After the BALB/C mouse models with subcutaneous xenograft model were established， the expression rate of IL-9 and the expression level of IL-9 mRNA in the experimental group were significantly higher compared with those in the control group（all P < 0.05）.  Conclusions The CT-26 cell lines stably over-expressing IL-9 gene and the BALB/C mouse models with subcutaneous xenograft model are successfully established.

【Key words】Lentiviral transfection;IL-9 gene;CT-26 cell;BALB/C mouse;Xenograft model

结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率居于第3位[1]。在我国，结肠癌的发病率及病死率呈现逐年上升趋势，每年因结肠癌死亡人数在恶性肿瘤中居于第5位[2]。结肠癌除传统的手术、化学治疗及放射治疗等治疗方式，免疫基因治疗逐渐呈现其优越性，因此寻找免疫治疗的新策略对于结肠癌的治疗至关重要[3-4]。

IL-9最早于1988年由Uyttenhove等在建立的多个Th2细胞株中发现，主要来源于活化的Th9细胞，近年来逐渐发现IL-9具有抗肿瘤免疫作用[5-6]。研究通过建立小鼠黑色素瘤、鳞癌模型及Th9抗原特异性疫苗，发现IL-9表现出明显的抗肿瘤作用且可抑制肿瘤细胞的种植及扩散[7-10]。Huang等[11]研究发现，IL-9在结肠癌患者的癌组织及血浆中均呈低表达，且IL-9与结肠癌TNM分期关系密切，提示IL-9低表达与结肠癌进展相关。IL-9作为一个潜在的免疫基因靶点，对于指导结肠癌的基础和临床研究以及免疫基因治疗具有重要意义。本研究旨在建立稳定过表达IL-9的小鼠结肠癌CT-26细胞株以及BALB/C小鼠皮下移植瘤模型，为后续研究IL-9在结肠癌肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫作用及其机制提供研究基础。

材料与方法

一、过表达IL-9-GV492慢病毒载体的构建

环状慢病毒质粒载体GV492携带绿色荧光蛋白（GFP）及BamHI/AgeI酶切位点，利用限制性内切酶（NEB公司）获得线性化载体，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的条带;GV492载体，BamHI/AgeI 酶切，购自上海吉凯基因化学技术有限公司。从购买的cDNA文库中利用反转录PCR法获取鼠源性实验目的基因IL-9，由上海吉凯基因化学技术有限公司设计引物，引物均含BamHI/AgeI酶切位点，其序列为：IL-9-F，5-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTG-3;IL-9-R，5-TCCTTGTAGTCCATACCTGGTCGGCTTTTCTGCCTTTGC-3。按照如下反应条件：98℃5 min循环1次，98℃10 s、55℃10 s、72℃90 s循环30次，72℃8 min循环1次进行PCR扩增目的基因片段，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳鉴定。将PCR产物与线性化载体在37℃反应30 min，冰水浴中冷却5 min进行重组反应，从而实现线性化载体和目的基因IL-9片段的体外环化;随后将重组产物加入到感受态大肠杆菌菌株DH5α中，并在LB培养基中进行转化。

挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，引物序列为：F，5-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3;R，5-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3。按照如下反应条件：94℃3 min循环1次，94℃30 s、55℃30 s、

72℃30 s循環22次，72℃5 min循环1次进行PCR，产物利用琼脂糖凝胶电泳鉴定，空白对照以ddH20为模版，阴性对照以未插入目的基因的空载体为模版，阳性对照以含有GAPDH基因为模板。将鉴定的阳性克隆接种于含抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12 ～ 16 h后取适量菌液测序及结果分析。随后将测序正确的菌液用无内毒素质粒抽提试剂盒（Qiagen公司）抽提质粒，获得高纯度质粒，用于下游病毒包装。

二、质粒表达检测、慢病毒包装和病毒滴度检测

转染前24 h，将处于对数生长期的慢病毒包装细胞293T以含10%血清的培养基调整细胞密度约5×109/15 ml，并接种于10 cm培养皿进行培养。将抽提的质粒DNA溶液（包括目的基因质粒、阴性对照、阳性对照）转染293T细胞，培养6 h后弃去含转染混合物的培养基，以含10%血清的培养基于37℃、含5%CO2的环境中继续培养48 ～ 72 h。转染后48 h，用倒置荧光显微镜观察转染后细胞的荧光表达强度并拍照。同时收集293T细胞用蛋白免疫印迹法检测目的基因IL-9的表达情况;SDS-PAGE分离胶浓度为10 %，蛋白上样量为20 ?g;IL-9一抗购于Sigma公司，稀释比例为1∶3 000，二抗购于santa-cruz公司，稀释比例为1∶4 000;最后用ECL成像系统ECL法结合X线片曝光、成像，观察3组条带的不同。

获得预期检测结果后，收集294T细胞上清液，离心去除细胞碎片，超速离心浓缩后，加入病毒保存液或细胞培养基，充分溶解离心后，去上清将病毒原液进行分装、保存。同时准备样本进行病毒滴度的检测，测定前1 d，将293T细胞按4×109/孔铺于96孔板，按照设置的梯度浓度加入病毒原液，培养4 d后用倒置荧光显微镜观察荧光的表达情况，按公式：病毒滴度=荧光细胞数/病毒原液量计算病毒滴度。

三、稳定过表达IL-9的小鼠结肠癌CT-26细胞的建立

取对数生长期的小鼠结肠癌CT-26细胞，用含10%FBS（四季青生物制品公司）的1 640完全培养基（Hyclone公司）制成3×104 ～ 5×104/ml的细胞悬液。根据转染病毒的不同将细胞分为3组，分别为：空白对照组（Control组）、阴性对照组（LV-NC组）和实验组（LV-IL-9组）。按照上述分组分别接种5×104个细胞于6孔板中，接种体积为2 ml，待细胞融合度约30%时，加入10 μl的1×108 TU/ml的慢病毒液（空白对照组不加病毒，阴性对照组加入IL-9阴性病毒，实验组加入过表达IL-9病毒），慢病毒转染12 h后换回常规培养基继续培养，途中根据细胞生长状态进行换液，转染48 h后应用倒置荧光显微镜观察3组感染效率并拍照。

若感染效率达80%以上，即应用流式细胞仪检测3组细胞的病毒转染阳性率（GFP）及实验组和对照组IL-9表达情况。将3组细胞消化、离心、重悬后，室温、暗室、固定20 min，破膜，加入IL-9抗体（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司），抗体与100μl的1×Perm Wash Buffer按1∶100使用，4℃、避光，孵育30 min，离心后弃上清，Hanks重悬细胞，转移至流式管上流式细胞仪检测。

同时，用qRT-PCR法检测3组细胞中IL-9的mRNA表达情况。提取3组细胞的总RNA后，使用Prime ScriptRT Master 试剂盒行逆转录反应，反应程序：37℃ 15 min，85℃ 15 s，4℃ 1 min，使RNA逆转录成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，反应程序：95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 30 s，共40个循环，进行PCR扩增。根据仪器自动计算所得每组标本的Ct值，计算目的基因mRNA的相对表达量2-ΔΔCt，△△Ct=实验组△Ct -对照组△Ct，△Ct=目的基因Ct值-內参Ct值。引物序列如下：IL-9-F，5-CTCTGTTTGGGCATTCCCTCT-3，IL-9-R，5-GGGTATCTTGTTTGCATGGTGG-3;GAPDH -F，5-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3，GAPDH-R，5-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3。

四、BALB/C小鼠皮下移植瘤模型的建立

取对数生长期的过表达IL-9（实验组）和不表达IL-9（阴性对照组）的慢病毒转染后的小鼠结肠癌CT-26细胞，分别移入75 ml培养瓶中扩大培养，待细胞长满予PBS重悬制成2×107/ml的细胞悬液。取6周龄BALB/C雌性小鼠12只，实验组和阴性对照组各6只，将50 ?l细胞悬液（约 10×105个细胞）混匀后用1 ml注射器行右侧腹部皮下种植，2组小鼠做好标记，于苏州大学实验动物中心SPF级饲养。第26日用颈椎脱臼法处死小鼠，于无菌环境中取出肿瘤。实验过程符合伦理学规定。

肿瘤分为2份：1份予以10%甲醛溶液固定，石蜡切片，备做免疫组织化学（组化）。融蜡、脱蜡、脱水，柠檬酸缓冲液冲洗，灭活内源性过氧化物酶，3%BSA避光孵育30 min，滴加IL-9一抗（按1∶200稀释），避光4℃孵育过夜。加二抗，DAB染色，苏木精复染，梯度浓度乙醇脱水，中性树脂封片，倒置显微镜下观察2组肿瘤IL-9表达情况并拍照。一抗、二抗均购于Abcam公司。IL-9主要在正常细胞胞质中表达，以棕黄色颗粒为染色阳性。随机选择10个400倍视野，计数阳性细胞所占比例并计分：< 5%计0分，5% ～ 35%计1分（含35%），35% ～ 70%计2分（不含35%），> 70%计3分;同时按染色强度计分：未显色计0分，淡黄色计1分，黄棕色计2分，棕褐色计3分。免疫组化结果以阳性染色细胞比例与染色强度的乘积结果判定：< 2分为IL-9表达阴性，≥2分为IL-9表达阳性。

另1份肿瘤立即保存于-80℃冰箱，准备做qRT-PCR，实验步骤同上。

五、统计学处理

采用SPSS 19.0进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验;多组间均数的比较采用单因素方差分析，两两比较时采用LSD-t检验。定性资料用率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、过表达IL-9-GV492慢病毒载体的构建及鉴定

环状慢病毒质粒载体GV492经BamHI/AgeI 酶切，获得线性化载体，其酶切电泳图。目的基因IL-9片段PCR扩增产物大小约485 bp，符合预期结果。阳性对照组质粒扩增可见片段条带，空白对照及阴性对照组未见质粒扩增片段，重组质粒阳性转化子PCR产物大小约617bp。阳性克隆DNA测序与目的基因序列比对分析的结果为：重组质粒的编码序列与目标序列完全一致，说明过表达IL-9-GV492慢病毒载体的构建成功。

二、质粒转染后293T细胞的荧光和蛋白表达以及慢病毒滴度

过表达IL-9质粒转染293T细胞后，细胞内可见明显的荧光，观察视野内携带绿色荧光的细胞约在90%以上，说明目的质粒转染正常、目的质粒基因荧光表达正常。蛋白免疫印迹法发现重组质粒转染293T细胞表达IL-9，34 kDa附近存在特异性条带，而293T细胞本身不表达IL-9 ，说明重组质粒过表达IL-9基因。慢病毒滴度结果为2×109 TU/ml。

三、稳定过表达IL-9的小鼠结肠癌CT-26细胞的建立及鉴定

倒置荧光显微镜观察慢病毒转染后CT-26细胞：Control组细胞无荧光表达，LV-NC组及LV-IL-9组观察视野内携带绿色荧光的细胞均约在90%以上。Control组、LV-NC组、LV-IL-9组GFP表达阳性率分别为0、96.4%、91.2%，LV-IL-9组IL-9的平均荧光强度（MFI）高于LV-NC组，即LV-IL-9组过表达IL-9，且差异具有统计学意义（t=5.947，P < 0.01）。以LV-IL-9组IL-9的mRNA表达量均值为1，则LV-IL-9组IL-9的mRNA相对表达量（1.000±0.203）高于LV-NC组（0.189±0.078）和Control组（0.227±0.132），差异均具有统计学意义（P均< 0.001）;而LV-NC组和Control组的mRNA相对表达量相近（P > 0.05）。说明稳定过表达IL-9的小鼠结肠癌CT-26细胞的建立成功。

四、建立BALB/C小鼠皮下移植瘤模型

LV-IL-9组和LV-NC组的小鼠成瘤率均为100%。与LV-NC组小鼠相比，LV-IL-9组小鼠肿瘤的生长速度较慢，最终瘤体较小，差异有统计学意义（P < 0.05）。免疫组化显示LV-IL-9组小鼠肿瘤IL-9的阳性表达率（100%）高于LV-NC组（33.3%），差异有统计学意义（χ2= 6.000，P=0.014）。以LV-IL-9组IL-9的mRNA表达量均值为1，则LV-IL-9组IL-9的mRNA相对表达量（1.000±0.178）高于LV-NC组（0.375±0.106），差异有统计学意义（t = 9.060，P < 0.001）。说明过表达IL-9小鼠结肠癌CT-26细胞BALB/C小鼠皮下移植瘤模型建立成功。

讨论

基因治疗是以人的遗传基因为研究基础的新兴疾病治疗方法，其通过将正常有功能的基因引入到靶细胞用以补偿或纠正致病的缺陷基因，最终达到治疗疾病的目的[12-13]。从20世纪七八十年代开始，随着DNA重组及基因克隆技术的成熟和发展，基因治疗逐渐显示出其治疗疾病的优越性，并成为当前热门的疾病治疗方法和研究热点[14]。肿瘤免疫治疗是指通过激发和增强机体的免疫功能，从而达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的[15]。而肿瘤的免疫基因治疗是通过外源性向肿瘤或体细胞内引入某些细胞因子基因或共刺激分子基因，激发或调动机体的免疫功能以最终治疗肿瘤，因其具有安全性及有效性等优点，已成为目前肿瘤免疫研究和治疗中常见的方法[16]。研究发现，IL-9通过诱导树突状细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞和CD8 T细胞的活化，产生抗肿瘤免疫应答，从而抑制肿瘤生长，显示出强大的抗肿瘤免疫作用。IL-9作为新型免疫基因靶点，对于结肠癌的免疫基因治疗具有重要研究价值。

基因載体是基因治疗中的运载工具，可将目的基因导入宿主细胞进行复制或表达。脂质体等非病毒载体作为基因转染的工具有转染效率低且无法长期表达等缺点，因此本研究采用慢病毒载体，其以HIV为基础，可感染分裂细胞和非分裂细胞，除了具有在体力长期表达等优点外，当慢病毒载体感染目的细胞后，不会再感染其他细胞且不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，安全系数极高。本研究所用的慢病毒载体系统由GV492、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体等3种质粒所组成，载体中除了含有HIV的基本元件5LTR和3LTR外，还有携带绿色荧光标记的GFP、BamHI/AgeI 酶切位点和嘌呤霉素抗性。

本研究将酶切后的线性化载体和PCR扩增的IL-9基因产物进行体外环化，重组转化后成功获得IL-9-GV492重组质粒，转染293T细胞后，GFP表达效率高，且有效地过表达IL-9，慢病毒滴度达2×109 TU/ml，说明过表达IL-9的慢病毒构建成功。过表达IL-9的慢病毒转染小鼠结肠癌CT-26细胞后发现，LV-IL-9组和LV-NC组的GFP表达率明显高于Control组，且LV-IL-9组IL-9的表达明显高于LV-NC组，说明慢病毒转染CT-26细胞成功，且转染后实验组细胞过表达IL-9。过表达和不表达IL-9-CT-26细胞皮下种植BALB/C小鼠，以第26日作为观察点，过表达IL-9组的小鼠肿瘤阳性表达IL-9，而阴性对照组的小鼠肿瘤阴性表达IL-9，且差异有统计学意义，说明BALB/C小鼠皮下移植瘤模型建立成功。

综上所述，本实验成功建立稳定过表达IL-9的小鼠结肠癌CT-26细胞株及BALB/C小鼠皮下移植瘤模型，为进一步研究IL-9在结肠癌肿瘤微环境中的作用及其机制奠定了基础。

参 考 文 献

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（收稿日期：2018-12-18）

（本文編辑：杨江瑜）