紫花前胡素对CCl4致小鼠肝损伤的保护作用

李宝红，李尽文，欧阳贵锦，许月莹，梁淇峰，黎梓蕊，李 莉

(广东医科大学东莞科研中心 药学院，广东 东莞 523808)

肝脏是重要而复杂的代谢生理器官，被喻为“人体最大的化工厂”。在我国，肝脏疾病发病率高且范围广，给人们的健康和生活造成了极大的危害和负担[1]。因此，寻找有效的预防和治疗因各种原因所致的肝损伤的药物或功能食品，具有广阔的前景和深远的意义。

近些年来，随着提取、纯化工艺的迅速发展，天然产物药物治疗疾病得到大量学者的关注和认可，取得了很大进展；此类药物具有多靶点、副作用小的特点，对有效预防和治疗肝损伤的防治有一定的优势。朝鲜当归(Angelica gigas Nakai)，味辛性温，主要分布于韩国、朝鲜、日本及我国东北各省。紫花前胡素是香豆素类化合物，是朝鲜当归的主要药效成分，具有广泛的药理作用。研究表明，紫花前胡素可以用于治疗白血病、糖尿病、高血压、肾毒素以及肿瘤等，效果良好[2-3]。然而，目前紫花前胡素对四氯化碳(CCl4)诱导的急性肝损伤的作用鲜有报道。本研究拟采用CCl4诱导小鼠建立急性肝损伤模型，观察紫花前胡素对急性肝损伤的影响，为其在药物和保健品研发中的发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

四氯化碳(CCl4)、DPPH，美国Sigma公司；紫花前胡素，上海源叶生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，碧云天生物科技有限公司；丙氨酸氨基转移酶试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒、抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒、羟自由基测试试剂盒，南京建成生物技术有限公司；过硫酸钾分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

清洁级雄性ICR小鼠购自南方医科大学实验动物中心，实验动物合格证号：SYXK(粤)2016-0167，饲养于广东医科大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2015-0147，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2013-0008。

1.2 实验动物分组、模型建立与给药方法

将50只健康雄性ICR小鼠 (20±2 g) 每组10只随机分组，正常对照组，CCl4肝损伤模型组，紫花前胡素低、中、高剂量组 (50,100,200 mg/kg)。给药组分别按各剂量紫花前胡素进行灌胃，正常组、模型组按等体积生理盐水灌胃，共30 d，隔天给药。末次给药1 h后，正常组腹腔注射等体积玉米油，模型组和紫花前胡素给药组腹腔注射10 mL/kg CCl4，禁食不禁水继续饲养24 h。各组小鼠眼眶静脉丛取血，离心取血清于4 ℃保存备用。采血后处死小鼠，迅速取肝组织，用冷生理盐水洗涤干净，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 血清学指标检测

按照试剂盒操作说明书，采用酶标仪检测各组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性。

1.4 肝脏组织细胞色素酶CYP2E1检测

取等量肝脏组织，剪碎后于匀浆器将肝脏组织匀浆，将匀浆液于4℃超速离心，取上清液。按照试剂盒操作说明书，采用酶联免疫吸附法检测小鼠肝组织CYP2E1水平。

1.5 紫花前胡素清除超氧阴离子能力的检测

以维生素E为阳性对照，按照试剂盒操作说明书，利用酶标仪，于波长550nm处比色，检测紫花前胡素清除超氧阴离子能力。

1.6 紫花前胡素清除羟自由基能力的检测

以维生素E为阳性对照，按照试剂盒操作说明书，利用可见分光光度计，于波长550nm处比色，检测紫花前胡素清除羟自由基能力。

1.7 统计学分析

数据结果用x±s表示，利用Prism 5软件，one-way ANOVA检验，以p<0.05为显著性差异，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 紫花前胡素对CCl4诱导急性肝损伤小鼠血清ALT、AST活力的影响

表1 紫花前胡素对CCl4诱导急性 肝损伤小鼠血清ALT、AST活力的影响

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

如表1所示，在采用腹腔注射CCl4后，与正常组小鼠对比，模型组小鼠血清ALT和AST的活力显著升高，表明造模成功。与模型组小鼠相比，紫花前胡素给药组能够显著降低ALT和AST的活力，且呈浓度依赖性，表明小鼠提前给予紫花前胡素能够对CCl4诱导的急性肝损伤起到一定的缓解作用。

2.2 紫花前胡素对CCl4诱导急性肝损伤小鼠肝组织细胞色素酶CYP2E1的影响

图1结果显示，在采用腹腔注射CCl4后，与正常组小鼠对比，模型组小鼠CYP2E1的含量显著升高，而提前给予低、中、高浓度紫花前胡素灌胃给药后，与模型组比较，CYP2E1的含量显著降低 (P < 0.05)，提示紫花前胡素可能通过调节机体CYP2E1的含量来抵御CCl4诱导的肝损伤。

图1 紫花前胡素对CCl4诱导 急性肝损伤小鼠肝组织CYP2E1的影响

2.3 紫花前胡素在体外对超氧阴离子及羟自由基的清除能力

紫花前胡素在体外，超氧阴离子及羟自由基的清除能力随浓度增加呈上升趋势，且与维生素E阳性对照组的增强幅度相似，但其自由基清除效果不如同等浓度的维生素E阳性对照组。

图2 紫花前胡素在体外对超氧阴离子及羟自由基的清除能力

3 讨论

本研究利用CCl4诱导小鼠建立急性肝损伤模型，观察紫花前胡素对其保护作用及可能的机制。CCl4在肝细胞内，经细胞色素酶CYP450作用，能够生成三氯甲基(CCl3·)等自由基，而生成的自由基可以攻击细胞膜脂质双分子层[4]，进而改变细胞膜的通透性，肝细胞内大量酶释放到血液中，包括ALT及AST。因此，通过检测血清中的ALT和AST的含量能够判断肝脏受损伤程度[5]。本研究结果表明，提前给予紫花前胡素对小鼠进行灌胃，可以有效抑制CCl4引起的血清ALT及AST的升高，提示紫花前胡素对CCl4导致的小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用。而在进一步检测中，我们发现各浓度紫花前胡素处理组能够有效抑制细胞色素酶CYP2E1的产生，提示紫花前胡素可能减少CCl3·等自由基的产生，进而实现其对肝损伤的保护作用。

此外，我们观察了紫花前胡素在体外对自由基的清除能力。超氧阴离子和羟自由基均具有极强的氧化能力，能够攻击机体造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸及脂类等生物大分子，进而导致细胞死亡[6]。我们的结果表明，在体外，紫花前胡素能够有效的清除超氧阴离子及羟自由基，具有较强的抗氧化活性。因此，我们推测紫花前胡素能够抗氧化进而实现对肝损伤的保护作用。

4 结论

研究结果表明，紫花前胡素对CCl4导致的小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用，推测可能是通过抑制细胞色素酶CYP2E1的产生进而减少三氯甲基等自由基的产生实现的。此外，紫花前胡素自身的清除自由基的能力也能够较好的预防和改善肝损伤。但紫花前胡素是如何抑制CYP2E1产生的需要进一步的研究。本研究为紫花前胡素在临床治疗肝损伤提供了初步的实验依据。