黄柏醇提物与氨苄青霉素联用对大肠杆菌的体外抑菌作用

王 敬，田 蓓

(1．武汉华夏理工学院生物制药工程系，湖北 武汉 430223；2.浙江工业大学生物工程学院，浙江 杭州 310014)

自1940年青霉素用于临床治疗各种感染性疾病，70多年来，它挽救了无数人的生命，为维护人类的健康立下汗马功劳。但由于抗生素的不合理使用，导致许多细菌产生耐药性。为应对细菌耐药性引发的不良后果，除了致力于筛选对耐药菌有效且具有新抗菌谱、新作用机制的抗生素外，人们开始寻找能提高抗生素效能、拮抗细菌耐药性的物质。黄柏中的小檗碱抗菌谱广，体外对多种细菌具有抑菌作用，关于小檗碱的抑菌机制，目前主要有以下几方面的报道：①抑制拓扑异构酶的活性[1]。拓扑异构酶能够催化DNA链的断裂和结合，从而抑制细菌DNA的合成。目前针对拓扑异构酶这一作用位点设计具有杀伤肿瘤细胞的药物已成为研究的热点。②拮抗细菌产生的肠毒素[2]。③降低细菌对细胞的粘附性[3]。④与细菌核糖体30S亚基结合影响蛋白质的合成[4]。同时小檗碱还能增强白细胞及肝网状内皮系统的吞噬能力。本论文主要研究黄柏70%乙醇粗提物与氨苄青霉素联合使用时对大肠杆菌的体外抑菌效果，旨在为临床合理利用中草药、中西医结合治疗细菌感染提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大肠杆菌(由武汉华夏理工学院微生物实验室提供)。

1.1.2 药物

黄柏(购自武汉三九药店)。

1.1.3 培养基

MHA培养基(购自青岛海博生物公司)，用于测定药物的MIC值；牛肉膏蛋白胨液体培养基，用于制备大肠杆菌菌液；牛肉膏蛋白胨斜面培养基，用于活化大肠杆菌。

1.2 方法

1.2.1 黄柏70%乙醇粗提物的制备

量筒量取378 mL无水乙醇，加入42 mL蒸馏水，配制成70%的乙醇溶液420 mL。取黄柏药材适量，粉碎，过20目筛，称取药粉20g，用70%乙醇水浴回流提取三次[5]，每次用溶剂140 mL，提取1 h，过滤，合并三次提取滤液，将滤液置离心机中，于3000 r/min离心2 min，取上清液加热浓缩，回收乙醇，直至浓缩液体积为20 mL，相当于原黄柏的浓度为1000 mg/mL，将浓缩液装入试管，塞好棉塞，放入高压蒸汽灭菌锅，121 ℃灭菌20 min后，4 ℃冰箱冷藏备用。

1.2.2 大肠杆菌菌液制备

取新鲜培养的大肠杆菌斜面菌种一支，接入含牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，置37 ℃摇床200 r/min恒温培养18 h，加入无菌蒸馏水调整大肠杆菌菌液浓度，使其在600 nm处的吸光度为0.4左右，稀释好的菌液备用。

1.2.3 黄柏70%乙醇粗提物的MIC值测定

取十支大试管，先各加入8 mL溶化的MHA培养基，然后吸取黄柏70%乙醇粗提物8 mL加入第一支试管，混合均匀后吸出8 mL液体放入第二支试管，依次类推，梯度稀释，直到第八支试管。第八支试管吸出8 mL液体丢弃。八支试管所含溶液相当于原黄柏质量浓度分别为500 g/L,250 g/L,125 g/L,62.5 g/L,31.3 g/L,15.7 g/L,7.8 g/L,3.9 g/L。第九支、第十支试管里只装8 mLMHA培养基用于制作对照。十支试管灭菌后，分别倒入已干燥好的无菌培养皿内凝固使用。在培养皿底部标记接种的位置和药液浓度，接种制备好的大肠杆菌稀释液。其中第九个培养皿不接菌作为阴性对照，第十个培养皿接菌作为阳性对照。将所有平板倒置放入37 ℃恒温培养箱中培养18 h。

1.2.4 氨苄青霉素的MIC值测定

用无菌生理盐水将氨苄青霉素钠粉针配制成质量浓度为50 g/L的溶液，微孔滤膜过滤备用。准备十支已灭菌的装有9 mLMHA培养基的试管，吸取1 mL 50 g/L的氨苄青霉素加入第一支试管，混合均匀后，从中吸取1 mL溶液加入第二支试管中，以此类推，梯度稀释，直到第八支试管。第八支试管吸出1 mL液体丢弃。八支试管中氨苄青霉素的质量浓度分别为5 g/L,5×10-1g/L,5×10-2g/L，5×10-3g/L，5×10-4g/L，5×10-5g/L,5×10-6g/L,5×10-7g/L。第九支、第十支试管里只装9 mLMHA培养基用于制作对照。将十支试管内含物分别倒入已干燥好的无菌培养皿内凝固使用。在培养皿底部标记接种的位置和药液浓度，接种制备好的大肠杆菌稀释液。其中第九个培养皿不接菌作为阴性对照，第十个培养皿接菌作为阳性对照。将所有平板倒置放入37 ℃恒温培养箱中培养18 h。

1.2.5 黄柏70%乙醇粗提物与氨苄青霉素联用的FIC指数测定

取含有黄柏70%乙醇粗提物1/16MIC,1/8MIC,1/4MIC,1/2MIC,MIC，2MIC的MHA培养基，分别与含有氨苄青霉素10-4MIC,10-3MIC,10-2MIC,10-1MIC,MIC,10MIC的MHA培养基，两两等量混合，制成36个联合含药平板。混合后黄柏70%乙醇粗提物相当于原黄柏的质量浓度为31.3 g/L，15.7 g/L，7.8 g/L，3.9 g/L，1.95 g/L，0.975 g/L,氨苄青霉素终浓度为2.5×10-5g/L，2.5×10-6g/L，2.5×10-7g/L，2.5×10-8g/L，2.5×10-9g/L，2.5×10-10g/L。另制备两份空白培养基作为阴、阳性对照。接种，待菌液完全吸收后，将38个培养皿倒置放入37 ℃恒温培养箱培养18 h，以不能产生肉眼可见的菌落为标准，记录两种药物联合使用时的MIC,根据公式计算FIC。当FIC指数小于0.5时，两种药物联用表现协同效应；指数在0.5～1时，为累加效应；指数大于1小于2时，为无关效应，大于2时为拮抗效应。

2 结果与讨论

2.1 MIC值测定结果

取出平行的一组培养皿及阴阳性对照，观察有无肉眼可见菌落。黄柏70%乙醇粗提物的MIC值测定结果见表1，质量浓度为500 g/L,250 g/L,125 g/L,62.5 g/L,31.3 g/L,15.7 g/L的含药平板上无菌落生长，表明黄柏70%乙醇粗提物的MIC值为15.7 g/L。氨苄青霉素的MIC值测定结果见表2，质量浓度为5 g/L,5×10-1g/L,5×10-2g/L，5×10-3g/L，5×10-4g/L，5×10-5g/L的含药平板上无菌落生长，表明氨苄青霉素的MIC值为5×10-5g/L。

表1 黄柏70%乙醇粗提物的MIC Table 1 The MIC of 70% ethanol crude extract of Cortex Phellodendri

表2 氨苄青霉素的MIC Table 2 The MIC of ampicillin

注："-"代表无菌落，"+"代表有菌落。Note:"-"means no colony,"+"means colony

2.2 FIC值测定结果

取出38个含药培养皿，观察有无肉眼可见菌落。由表3可知，两药联用后，黄柏70%乙醇粗提物的MIC为7.8 g/L，为单药用量的1/2；氨苄青霉素的MIC为2.5×10-8g/L，为单药用量的1/2000。根据分级抑菌浓度计算公式，FIC指数=MIC(A组联合)/MIC(A组单用)+ MIC(B组联合)/MIC(B组单用)，得到FIC指数约为0.5005，在0.5～1之间，所以黄柏70%乙醇提取物和氨苄青霉素联用表现为累加效应[6]。

表3 黄柏70%乙醇粗提物和氨苄青霉素的联合抑菌结果 Table 3 Combined inhibition results of 70% ethanol crude extract from cortex phellodendri and ampicillain

注:A药为黄柏70%乙醇粗提物；B药为氨苄青霉素。Note:"A" means the 70% ethanol crude extract of cortex phellodendri; "B" means ampicillain.

2.3 讨论

黄柏70%乙醇粗提物与氨苄青霉素联合使用时表现累加效应，氨苄青霉素的MIC值下降到联合用药之前的1/2000，用量显著减少。科学选择中药与西药具有药效互补、疗效增强，降低细菌耐药性的产生等优点。

感染性疾病的发展进程与病原菌、宿主、药物三者密不可分。药物对症，宿主免疫力强，则病原菌清除的速度就快。部分中草药中的某些活性成分对病原微生物有直接抑制作用，如黄柏中的小檗碱已被证明在体外对多种革兰氏阳性及阴性菌均具有抑菌作用[7]。本试验采用70%乙醇回流提取法制备黄柏粗提液，主要目的是增加粗提液中小檗碱的含量。体外抗菌试验在相对静止条件下进行的，不受体内复杂因素的影响，结果只能说明药物对试验菌的直接抑菌作用，因此MIC值对指导临床用药剂量有一定的参考价值。另外，部分中药中的一些活性成分能调节机体平衡，增强免疫力，利于疾病治疗。如果要全面评价中药的治疗效果，对动物免疫机能的影响也应成为重要考察指标。