气相色谱-同位素稀释质谱法测定肉中多环芳烃含量

2019-07-05彭姚珊李永利

食品科学 2019年12期

彭姚珊，李永利，陈鹰，李杰*

（上海市计量测试技术研究院，上海 201203）

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指分子中含有两个或两个以上芳香环的烃类化合物，广泛存在于环境、食品及生物体内[1]。其中，美国环保署优先监测的有16 种，被欧盟法规关注的有15 种[2-3]。PAHs属于环境持久性污染物，具有生物累积性、不易降解等特点，有致畸、致癌、致突变作用[4]。大气、土壤和水体中的PAHs易被植物吸收，通过食物链的富集并传递，最终到达食物链高端的哺乳动物等生物体内，从而影响其神经系统、生殖系统等，给健康以致命威胁[4]。因此，研究肉及肉类制品中PAHs的高效检测方法具有重要意义，而对肉中富集的PAHs的检测分析同时在一定程度上反映了环境中PAHs的水平。

检测PAHs常用的仪器方法有高效液相色谱法[5-7]、液相色谱-串联质谱法[8-11]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[12-14]、气相色谱-串联质谱法[15-18]、毛细管电泳法[19]等。其中，GC-MS法相比于其他方法最大程度地排除了基体干扰，选择性好、灵敏度高，具有较好的定性、定量能力。

对于食品中痕量有机残留分析，由于具有待测物提取困难、干扰多等特点，采用外标法定量分析偏差较大，而选择与待测物理化性质非常接近的稳定同位素标记物作为内标的同位素稀释质谱（isotope diluted mass spectrometry，IDMS）法可以避免因食品复杂的基质效应、前处理和质谱检测器等因素对分析测定结果的影响[20-22]，有效地校正了方法中可能出现的误差，显著提高了检测方法的准确性。在众多前处理技术中，固相萃取技术具有简单、方便、节省时间的优点，被广泛应用于肉类等复杂基质样品的前处理。而使用分子印迹材料作为固相萃取填料的分子印迹固相萃取（molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE）技术由于分子印迹聚合物对某一类化合物具有特异性选择，使得其对目标化合物的选择性、分离效率和富集效率大大提高，有提取和净化的双重作用[18]。

本实验采用超声振荡结合MISPE技术对样品进行提取和净化，利用IDMS法校正前处理过程中待测成分的损失、降低基体效应的影响，建立了MISPE-GC-IDMS法同时对鲜肉及肉制品中16 种PAHs进行检测的方法，本方法高效、准确、灵敏，可以为食品安全监测中PAHs的检测工作提供可靠的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼肉、虾肉、鸡肉、肉松市售。

萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、䓛、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝16 种PAHs混合标准溶液（2 000 µg/mL）美国o2si公司；萘-D8（纯度＞99%）自制；正己烷、二氯甲烷（均为色谱纯）美国Honeywell公司；无水硫酸钠（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；CNW MISPE PAHs固相萃取小柱（500 mg/6 mL）上海安谱实验科技有限公司。

1.2 仪器与设备

6890N-5975B GC-MS联用仪（配电子电离源、G2614A自动进样器）美国Agilent公司；KQ-50DA超声振荡器昆山市超声仪器有限公司；PT 2500 E均质匀浆机德国Wiggens公司；L530R离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；R-215旋转蒸发仪瑞士Büchi公司；氮吹仪丹麦Jun-Air公司。

1.3 样品处理

1.3.1 提取

准确称取事先已搅碎（最长边不大于0.5 cm）的肉制样品4.000 0 g于研钵内，加入质量浓度为1 µg/mL的萘-D8同位素内标溶液100 µL，再加入8.0 g无水硫酸钠，充分研磨至粉末状，转移至50 mL离心管中，用10 mL正己烷-二氯甲烷（7∶3，V/V）冲洗钵体并转移至离心管中，再加入15 mL正己烷-二氯甲烷（7∶3，V/V），均质匀浆1 min，超声提取25 min，涡旋振荡1 min；以4 000 r/min离心10 min，上清液转移至梨形烧瓶；再加入25 mL正己烷-二氯甲烷（7∶3，V/V）重复均质匀浆及之后的过程，合并上清液，用旋转蒸发仪将合并的上清液在30 ℃旋转蒸干至近干，用2 mL正己烷复溶后待净化。

1.3.2 净化

用5 mL二氯甲烷活化固相萃取小柱，重复3 次后用5 mL正己烷平衡。转移1.3.1节中正己烷溶液至固相萃取柱顶部，再用3 mL正己烷荡洗梨形烧瓶并上样至固相萃取柱。用6 mL正己烷分3 次淋洗后用10 mL二氯甲烷分2 次洗脱，收集流出的二氯甲烷洗脱液。洗脱液用氮气吹干后用1 mL正己烷复溶，滤膜过滤后，在仪器分析条件下进行测定。

1.3.3 仪器分析条件

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：J&W DB-5MS石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；升温程序：50 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升至280 ℃；载气（He）流速1.0 mL/min，进样量0.5 µL；分流比10∶1。

1.3.3.2 质谱条件

电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；全扫模式及选择离子监测模式，16 种PAHs及同位素内标的质谱分析参数见表1，总离子流图见图1。

表1 16 种PAHs及同位素内标的保留时间及特征离子Table 1 Retention times and target ions for PAHs and isotope internal standard

图1 16 种PAHs及同位素内标物的总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatograms of 16 PAHs and isotope internal standard

2 结果与分析

2.1 样品提取条件的优化

图2 提取溶剂正己烷-二氯甲烷比例对PAHs回收率的影响Fig. 2 Comparison of PAHs recoveries with different extraction solvent compositions

根据文献报道[23-24]，肉中PAHs的提取多选用正己烷、二氯甲烷。PAHs在正己烷中分配比较高，但同时会提取出较多脂肪，干扰测试；PAHs和脂肪在二氯甲烷中的溶解度具有较大差异，可以降低脂肪引入的基质效应，但对PAHs的提取效率较低。为兼顾较高的提取效率和较小的基质效应，本实验采用正己烷和二氯甲烷的混合溶剂作为提取试剂，考察混合溶剂的不同比例对16 种PAHs提取效率的影响（图2）。结果表明，当正己烷-二氯甲烷（7∶3，V/V）时，大多数PAHs具有较好的萃取效率和较高的回收率，故选择此比例混合溶剂作为提取溶剂。

2.2 样品净化条件的选择

MISPE相比于传统固相萃取，具有特异识别性高、目标物选择吸附及富集能力强等特点[25]，在食品、环境样品检测中显示出对PAHs的显著专一吸附效果[26-27]。对比不同类型固相萃取填料对提取液中PAHs富集净化效果，图3表明：分子印迹固相萃取柱既可以有效去除提取液中脂肪等杂质，又能够较好地保留16 种PAHs，回收率在85%～110%之间，可达到分离富集目标化合物、降低基质效应、提高检测灵敏度的目的；硅胶固相萃取柱、中性氧化铝固相萃取柱、亲水亲脂固相萃取柱和C18固相萃取柱虽然对部分含2～3 个芳香环的PAHs具有较好的选择性吸附效果，但对苯并[b]荧蒽等含4 个或更多芳香环的PAHs回收率较低，不适合用于16 种PAHs的净化。

图3 固相萃取填料对PAHs回收率的影响Fig. 3 Comparison of PAHs recoveries with different types of SPE

2.3 标准曲线、检出限及定量限的测定结果

将质量浓度为2 000 µg/mL的PAHs混合标准储备液用正己烷稀释成质量浓度分别为5.0、10、20、50、100 ng/mL且内标萘-D8质量浓度均为20 ng/mL的系列溶液，按照仪器分析条件进行测定，并绘制标准曲线。结果表明：在5～100 ng/mL范围内，各PAHs与内标物峰面积的比值均与质量浓度的比值呈良好线性关系（线性方程见表2）；除茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝的检出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）分别为2.5 ng/mL和5.0 ng/mL外，其余PAHs的检出限和定量限分别为0.5 ng/mL和1.0 ng/mL，相当于样品中检出限为0.125～0.625 µg/kg、定量限为0.250～1.250 µg/kg，远优于GB 5009.265—2016《食品中多环芳烃的测定》方法[24]。当前我国对肉及肉制品仅限定苯并[a]芘的含量不得超过5.0 µg/kg[28]，虽然国标方法可以满足限量要求，但欧盟等对多种食品中PAHs含量要求愈发严格[29]，我国政府和人民群众也对食品中苯并[a]芘等高毒性物质关注度逐渐增强，仍需要更为灵敏的分析方法测定肉及肉制品中PAHs含量。