基于高效液相色谱法对农产品中吡虫啉的提取和净化

卢兰香，薛 霞，张艳侠，杨 昊，王 骏，祝建华，刘艳明*

（山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101）

吡虫啉，化学名称为1-(6-氯吡啶-3-吡啶基甲基)-N-硝基亚咪唑烷-2-基胺，为内吸性新烟碱类杀虫剂，具有广谱、高效、低毒、低残留，害虫不易产生抗性，对人、畜、植物和天敌安全等特点[1]，并具有触杀、胃毒和内吸等多重作用[2]，广泛应谷物、蔬菜、茶叶等大多数农作物。随着吡虫啉用量增多及使用范围的日益扩大，其安全性也备受关注。研究表明，吡虫啉影响蜜蜂的采食量和死亡率[3-4]，被人或动物长期食用后，会在体内蓄积，引起慢性中毒[5]。许多国家已经制定了吡虫啉在相关农产品中的最高允许限量。澳大利亚规定谷物中最高残留限量为0.05 mg/kg[6]；日本肯定列表中茶叶中的限量标准为10 mg/kg，蔬菜中的最大残留限量为5 mg/kg[7]；韩国也对茶叶中吡虫啉提出检测要求；我国GB 2763—2016《食品中农药最大残留限量》[1]中规定吡虫啉的最高残留限量：茶叶为0.5 mg/kg，谷物为0.05 mg/kg，黄瓜为1 mg/kg。

目前，吡虫啉的残留分析标准和研究方法主要有气相色谱（gas chromatography，GC）法[9-10]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[11-13]、高效液相色谱法[14-18]和液相色谱-串联质谱法[19-26]。GC和GC-MS方法常受到化合物极性、沸点及前处理方法相对复杂和耗时长等限制。液相色谱-串联质谱法仪器昂贵难以普及，基质效应严重，定量存在一定的局限性。高效液相色谱法具有普及率高、定量准确、兼容性好等特点，广泛用于农药残留的检测。已报道的吡虫啉残留的前处理技术主要包括加速溶剂萃取[27]、基质固相分散、分散固相萃取、微波辅助萃取、超临界流体萃取、凝胶渗透色谱[21]、液相微萃取[17-18,23]、分子印迹技术[28]、胶束介质萃取、逆固相基质分散法、QuEChERS（quick, easy,cheap, effective, rugged and safe）[16,25-26]和固相萃取（solid-phase extraction，SPE）[14-15,19-20]等。由于农产品样品的多样性和复杂性，常采用的净化方式有SPE和QuEChERS两种。对于农产品中吡虫啉的高效液相色谱检测方法法报道较多，但对于不同提取方式下不同基质中吡虫啉提取的影响，及不同净化方式对不同农产品的净化效果的系统研究鲜见报道。

本实验选取蔬菜中的黄瓜、谷物中的大米及茶叶3 种基质为研究对象，对直接用乙腈提取和加水后再用乙腈提取两种不同提取方式和SPE、QuEChERS两种净化方式进行深入讨论，拟建立吡虫啉农药残留的高效液相色谱检测方法。该方法可以为农产品中吡虫啉农药残留的监测提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶叶、大米、黄瓜 市购。

吡虫啉标准品 农业部环境质量监督检验测试中心（天津）；XBridge C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，3.5 µm） 美国Waters公司；醋酸钠提取盐试剂包（6 g MgSO4、1.5 g NaOAc）、15 mL PSA/C18净化管（400 mg乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、400 mg C18、1 200 mg MgSO4）、WondaSep GC-e/PSA（500 mg，500 mg，6 mL） 岛津技迩（上海）商贸有限公司；乙腈、甲苯（均为色谱纯） 美国Fisher公司；氯化钠（分析纯） 西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

2695高效液相色谱仪（配备2998二极管阵列检测器）美国Waters公司；AB204-S型电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；SB-800DTD型超声波清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷冻离心机 德国Sigma公司；Milli-Q超纯水制备器 美国Millipore公司；涡旋混合器 德国IKA公司；N-EVAP-45型氮吹仪美国Organomation Associates公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

取吡虫啉标准品（1 000 mg/L），使用前根据需要用乙腈-0.1%磷酸（1∶1，V/V）稀释至适当浓度的标准工作液，4 ℃避光保存。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 SPE处理过程

提取：称取适量（精确到0.01 g）粉碎均匀的试样（黄瓜10 g、大米5 g、茶叶2 g），置于50 mL聚丙烯具塞离心管中，加入10 mL水（大米和茶叶加水，黄瓜不加水），涡旋混匀，加入乙腈20 mL，涡旋，超声提取30 min。加入5 g氯化钠，剧烈振荡，静置，离心，使乙腈和水分层，取乙腈层10 mL于15 mL离心管中，45 ℃氮吹浓缩至近干。加入2 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）溶解残渣，待净化。

净化：分别用5 mL乙腈、5 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）活化SPE柱，将上述样品提取液分别上样，上样开始用15 mL离心管收集淋洗液，再用2 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）清洗装浓缩液的15 mL离心管（重复1 次），倒入SPE柱；剩余用约10 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）淋洗，收集所有流出液，氮吹至近干，用1 mL乙腈-0.1%磷酸（1∶1，V/V）复溶，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后上机测定。

1.3.2.2 QuEChERS处理过程

称取适量（精确到0.01 g）粉碎均匀的试样（黄瓜10 g、大米5 g、茶叶2 g），分别置于不同的50 mL聚丙烯具塞离心管中，加入10 mL水（大米和茶叶加水，黄瓜不加水），涡旋混匀，加入乙腈20 mL，涡旋，超声提取30 min。加入醋酸钠提取盐试剂包，剧烈摇匀后，超声提取20 min，离心，取上层提取液到15 mL PSA/C18净化管中，充分摇匀后离心。取上清液10 mL于15 mL离心管中，45 ℃氮吹浓缩至近干。用1 mL乙腈-0.1%磷酸（1∶1，V/V）复溶，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后上机测定。

1.3.3 模拟阳性样品的制作

大米模拟阳性样品的制作方法：把一定浓度的吡虫啉标准溶液加入一定量的大米中，充分混匀，然后使溶剂全部挥发，放置7 d，粉碎均匀，过20 目筛，混匀，得到添加量约1 mg/kg的模拟阳性样品。

黄瓜和茶叶的阳性样品：均购自于超市，经检测是阳性样品。

1.3.4 高效液相色谱条件

XBridge C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，3.5 µm）；流动相：0.1%磷酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脱程序：0～5 min，85%～80% A；5～15 min，80%～75% A；15～16 min，75%～5% A；16～20 min，5% A；20～21 min，5%～85% A；21～25 min，85% A；检测波长：270 nm；流速：0.8 mL/min。柱温：35 ℃；进样量：10 µL。

1.4 数据处理

通过与仪器配套的Empower 3色谱数据处理系统完成数据采集与处理，以及Origin 8.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 样品提取条件的优化

2.1.1.1 加水提取和不加水提取的比较

图1 提取方式对阳性样品吡虫啉提取效果的影响Fig. 1 Effect of different extraction methods on imidacloprid content in positive samples

农产品中吡虫啉的残留分析常用的提取溶剂有乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、甲醇等。由于乙腈的提取效率高，提取杂质少，有利于后续盐析和净化，操作简便，因此采用乙腈作为提取溶剂[13]。为验证不同提取条件对吡虫啉提取的影响，实验采用SPE净化方式，分别考察直接用乙腈提取和加水后再用乙腈提取对黄瓜、大米、茶叶阳性样品提取效果见图1；对阴性样品和阳性样品回收率的影响见图2。

由图1可见，对于阳性样品，大米、茶叶中吡虫啉的含量，加水提取是未加水提取的数倍；而黄瓜加水提取和不加水提取几乎无差异。原因可能是一方面大米和茶叶为干性样品，加水后能使其充分浸润，提取溶剂与样品能够充分接触；另一方面吡虫啉极性比较大，水的极性和渗透性强于乙腈和甲醇，加水后减弱了农药与基质之间的相互作用，所以加水后大米和茶叶中吡虫啉更容易被溶剂提取。而蔬类的黄瓜样品本身含有大量的水，所以直接用乙腈提取和加水后再用乙腈提取结果差异很小。

图2 提取方式对吡虫啉回收率的影响Fig. 2 Effect of different extraction methods on imidacloprid recovery

由图2可见，对于阳性样品和阴性样品，加水提取和不加水提取，不同农产品吡虫啉的回收率均不存在明显的差异，可能是由于加标时加入的吡虫啉为游离状态，即使不加水提取，也能够比较容易的被乙腈萃取，导致两种提取方式回收率都正常。

以上实验结果表明，不同基质的试样，虽然加水提取和不加水提取的回收率均正常，但是对于大米、茶叶等干性样品存在提取不完全的问题。所以实验选择黄瓜用乙腈直接提取，大米和茶叶加水后再用乙腈提取。

2.1.1.2 加水量的选择

如图3所示，采用SPE净化方式，当加水量2 mL和5 mL时，茶叶和大米样品不能完全浸润，但随着加水量的增加，检测结果变化很小。因此实验选择最终加水量为10 mL。

图3 加水体积对吡虫啉提取效果的影响Fig. 3 Effect of water added to agricultural products on the extraction efficiency of imidacloprid

2.1.1.3 浸泡时间的选择

图4 加水浸泡时间对吡虫啉提取效果的影响Fig. 4 Effect of soaking time on the extraction efficiency of imidacloprid

图4 表明：加水浸泡时间对大米、茶叶阳性样品提取率和阴性样品回收率的影响差异很小，而且随着浸泡时间的延长，提取出的干扰成分增多，不利于后续过程中目标物的净化和分离。因此，实验选择不浸泡。

2.1.2 样品净化方式选择

农产品种类繁多，基质比较复杂。比如蔬菜中存在的酚类、色素、有机酸、油脂、甾类、烯烃类等干扰物；茶叶中含有的大量色素、有机酸、茶多酚等物质。农产品中吡虫啉的残留分析中常用的净化方式有SPE和QuEChERS。吡虫啉农药残留分析的SPE净化方法中Carb-NH2[19-20]、Carb-PSA[14-15]两种小柱净化效果比较好。因为活性碳小柱能够有效去除色素，PSA、氨基（NH2）主要用于去除有机酸、脂肪酸、糖类及部分色素。但是两者相比，PSA有两个氨基，更能有效去除干扰，所以实验选用WondaSep GC-e/PSA小柱。而QuEChERS与传统方法相比，具有分析对象范围广、基质适用范围广、稳定性好、低成本、操作简单快捷等优点[29]。为验证这两种净化方式对吡虫啉净化效果的影响，实验采用黄瓜、大米、茶叶阳性样品按照1.3.2节方法进行实验，结果见图5。

由图5可见，大米基质简单，两种净化方式净化效果都比较好。对于黄瓜基质，QuEChERS净化方式杂峰较多，提取液色素不能被完全除去，净化效果不理想；虽然QuEChERS也能够实现目标物与杂质的分离，但SPE净化方式明显优于QuEChERS。而茶叶基质更复杂，采用QuEChERS净化方式时，茶叶中的脂肪酸、有机酸和极性色素等干扰基质不能被有效除去。采用SPE净化方式时，茶叶提取液无色透明，能够有效去除干扰基质，实现目标物与杂质的完全分离，达到净化目的。所以对于基质复杂的农产品优先选用SPE净化方式，而基质简单的样品QuEChERS与SPE净化效果差别不大。

图5 不同净化方式对阳性样品吡虫啉净化效果的影响Fig. 5 Comparison of different methods for the purification of imidacloprid

2.2 色谱条件的优化

实验比较Symmetry Shield C18、Xbrige C18、Atlantis T3三种色谱柱对分离效果的影响。结果发现相同的流动相条件下吡虫啉在Xbrige C18色谱柱的分离时间较Atlantis T3短，峰形优于Symmetry Shield C18。在等度分离时，由于农产品基质的复杂性，不易实现目标物与杂质的分离，而且容易干扰后续测定，所以实验采用梯度分离。

本实验比较文献中几种不同常用体系的流动相：甲醇和水、乙腈和水、甲醇和0.1%磷酸、乙腈和0.1%磷酸。结果表明：乙腈和0.1%磷酸分离效果和峰形最佳。

2.3 方法学评价

2.3.1 线性范围、检出限和定量限

将标准储备液用乙腈-0.1%磷酸（1∶1，V/V）逐级稀释得质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 µg/mL的系列标准工作溶液。将系列标准工作溶液按质量浓度从低到高的顺序，按1.3.4节条件进行测定，以吡虫啉峰面积（Y）对质量浓度（X）作标准曲线。采用空白基质加标的方法，以信噪比为10得到目标物的定量限，以信噪比为3得到目标物的检出限，结果见表1。吡虫啉在0.05～10.0 µg/mL之间线性关系良好，线性回归方程为：Y=9.31×104X＋3.87×103，R2=0.999。

表1 黄瓜、大米、茶叶3 种样品的检出限与定量限Table 1 Limits of detection and limits of quantitation for cucumber, rice and tea

图6 吡虫啉标准溶液（2.0 μg/mL）的高效液相色谱（A）和光谱（B）图Fig. 6 HPLC chromatogram (A) and spectrum (B) of imidacloprid standard solution

2.3.2 回收率和精密度实验结果

实验采取阴性样品中添加0.05、0.1 mg/kg和1.0 mg/kg进行加标回收实验，每个水平平行测定6 次，得到方法的回收率及精密度，见表2。结果显示，3 个水平的加标回收率在88.3%～109.1%之间，相对标准偏差在1.9%～3.5%之间。

表2 黄瓜、大米、茶叶3 种样品的回收率及精密度（n= 6）Table 2 Recoveries and precision (RSD) for spiked cucumber,rice and tea (n= 6)

2.4 实际样品的测定结果

应用本方法对市售的黄瓜、大米、茶叶各40 批次样品进行分析，吡虫啉残留量检测结果为：黄瓜有1 批次样品检出，含量为0.171 mg/kg，低于GB 2763—2016中规定的限量要求；大米均未检出；茶叶有6 批次样品检出，其中5 批次含量为0.102～0.425 mg/kg，1 批次高于GB 2763—2016的限量要求，含量为4.811 mg/kg。

3 结 论

本实验建立了农产品中吡虫啉农药残留的高效液相色谱检测方法。结果表明：加水和不加水两种不同的提取方式，对于含水量较高的蔬菜，结果无差异；而对于谷类、茶叶等干性样品，结果差异比较大，加水量和浸泡时间对结果影响很小。对于基质复杂的农产品SPE净化效果明显优于QuEChERS，而基质简单的农产品二者差别很小。本实验可为农产品中吡虫啉农药残留测定方法的建立提供技术支持。