低聚糖和多酚结合偏最小二乘判别分析鉴别油菜蜜产地

佘 僧，李 熠，宋洪波，陈兰珍,*

（1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；3.农业农村部蜂产品质量安全风险评估实验室（北京），北京 100093）

油菜属于十字花科中的一种草本植物，环境适应能力强、花期长、种植范围广。由2016年国家统计局公布的数据显示：我国油料产量为3 400.05万 t，油菜籽产量为1 312.80万 t，油菜籽播种面积达6 622.80千 公顷[1]。油菜种植在湖北、江苏、青海、四川等23 个省份基本全部覆盖，其中湖北属于我国最大的油菜籽生产区，江苏属于我国传统油菜籽主产区，青海随着新农业经济和旅游资源的开发，油菜的种植面积也在不断的扩增[2]。我国主导的蜂蜜采集仍属于传统的“追花夺蜜”模式，油菜不仅是我国重要的油料资源，也是优质的蜜源植物之一。我国油菜花开花时间从三月份的云贵高原、四川盆地至湖北、安徽等长江沿岸，四月份江苏沿海直至七、八月份青海、内蒙古草原，一直有大面积油菜花盛开。广阔的油菜种植面积和跨越半年的油菜花期，提供了庞大的油菜蜜源，油菜蜜也成为了我国目前产量最高和出口量最大的单花蜜品种。自2007年中国农产品地理标志管理条令正式发布后，具有名优产地标识的产品被伪冒产品销售给消费者的现象愈演愈烈，严重损害了优质品牌的信誉和消费者的信任，使得蜂蜜的产地溯源研究也变得更加迫切和需要[3-4]。油菜蜜作为我国单花蜜品种中蜜源植株分布最广，气候、地理环境最丰富的单花蜜品种，对研究蜂蜜的产地溯源具有重要的借鉴和参考价值。

蜂蜜的产地溯源技术主要包括稳定同位素技术、核磁共振技术、高效液相色谱-质谱联用技术、气相色谱-质谱技术等[5-6]。色谱技术可定性分析样品中营养物质成分，结合质谱后可获得营养成分的定量结果，对于分析样本的特定物质含量具有优势性。本实验采用高效液相色谱-质谱联用技术测定油菜蜜中的18 种多酚类物质，气相色谱-质谱测定油菜蜜中的6 种低聚糖结合偏最小二乘判别分析（partial least square-discrimination analysis，PLS-DA）实现3 个油菜蜜产区的地理鉴别。低聚糖是通过2～4 个糖苷键将单糖连接而成小分子聚合物[7]。低聚糖含量占蜂蜜营养物质的60%～80%，属于蜂蜜中最主要的成分[8]。蜂蜜中的功能性低聚糖甜度低，耐热耐酸强，不经过胃肠消化便可直接被人体吸收利用，不增加血糖、血脂且改善肠胃吸收消化，提高免疫力等功效[9]。Da Costa Leite等[10]通过测定70 个巴西不同植物蜜源蜂蜜品种的10 种低聚糖物质，研究发现松二糖、麦芽三糖、麦芽糖具有显著的品种鉴别能力。多酚广泛存在于植物的根、叶、果实当中，是植物次生代谢产物。蜂蜜中的多酚全部来源于蜜源植物。多酚类化合物是指分子结构中有若干个酚羟基，主要包括苯酚、酚酸和黄酮类化合物[11-13]，具有清除自由基的抗氧化活性功效，对心血管病、动脉硬化等疾病具有预防作用[14-17]。Kuś等[18]通过高效液相色谱-质谱联用分析6 种单花蜜中多酚含量及其抗氧化活性差异，该研究表明石楠蜜和荞麦蜜在6 种蜂蜜中抗氧化活性最高，且不同品种间的多酚含量具有显著性差异。Baltrusaityte等[19]通过对35 份蜂蜜样本中多酚提取物清除自由基能力进行实验，研究发现蜂蜜中多酚清除自由基能力平均在43%～95.7%之间，且抗氧化物质的含量与酚类化合物的含量呈显著相关。

目前，蜂蜜中低聚糖和多酚的研究，主要在于其营养医药价值、品种鉴别等方面，鲜见有关于两者相结合对于产地鉴别效果的研究报道。因此本实验采集湖北钟祥市、江苏盐城市、青海刚察县3 个不同地理环境的油菜蜜样本，通过定量分析3 个产地油菜蜜中低聚糖和多酚两个重要营养指标的含量差异，并结合PLS-DA进行产地溯源研究，为蜂蜜的产地溯源研究提供方法参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油菜蜜样本采自湖北钟祥市（ZX）、江苏盐城市（YC）、青海刚察县（GC）3 个不同地理来源的油菜主产区（表1）。3 个采样地点的选择具有显著代表性，ZX（n=12）属于内陆地区，位于我国第2阶梯高度，属于亚热带湿润季风气候区；YC（n=13）地处黄海入海口，位于我国第1阶梯高度，属于温带海洋性气候区；GC（n=26）地处青藏高原，位于我国第3阶梯高度，属于高原大陆性气候区。油菜植株均属于甘蓝型油菜，蜜蜂种类属于意大利蜂；所有样本均采自于油菜花盛花期，蜂场现场采集的样本。油菜蜜样本收集于250 mL玻璃瓶，封口膜密封，待测前贮存在4 ℃。

表1 样本来源信息Table 1 Information about different geographical origins of rapes honey samples

去离子水（电阻率18.2 MΩ·cm） 美国Agilent公司；乙腈、甲醇、甲酸、氨水、盐酸羟胺均为国产分析纯；吡啶、β-苯基葡萄糖苷 北京百灵威科技有限公司；HMDS＋TMS＋吡啶、麦芽酮糖（纯度≥98.0%）、松二糖（纯度≥98%）、蔗果三糖（纯度≥97.0%）、帕拉金糖（纯度≥95.0%）、异麦芽糖（纯度≥97%）、吡喃基葡蔗糖（纯度≥97%）、没食子酸（纯度≥98.0%）、原儿茶酸（纯度≥98.0%）、对羟基苯甲酸（纯度≥98.0%）、咖啡酸（纯度≥98.0%）、对香豆酸（纯度≥98.0%）、阿魏酸（纯度≥98.0%）、芦丁（纯度≥98.0%）、苯甲酸（纯度≥98.0%）、杨梅酮（纯度≥98.0%）、桑色素（纯度≥98.0%）、槲皮素（纯度≥98.0%）、柚皮苷（纯度≥98.0%）、芹菜素（纯度≥98.0%）、山柰素（纯度≥98.0%）、柯因（纯度≥98.0%）、松属素（纯度≥98.0%）、咖啡酸苯乙酯（纯度≥98.0%）、高良姜素（纯度≥98.0%） 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

Milli-Q型纯水器 美国Millipore公司；PHS-3E pH计上海仪电科学仪器股份有限公司；微量移液枪 德国Eppendorf公司；Vortex-Genie 2涡旋仪 美国Scientific Industry公司；PL203电子天平 美国Mettler-Toledo公司；QP2010-PIUS气相色谱-串联质谱 日本Shimadzu公司；6460高效液相色谱-串联质谱 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 低聚糖测定

油菜蜜中6 种低聚糖含量的测定方法参考文献[20-21]方法。称取油菜蜜样本0.5 g于25 mL离心管中，置于40 ℃水浴锅中溶解完全。随后在溶解液中加入25 mL 80%乙醇溶液，搅拌至溶解完全，10 000 r/min离心10 min。取上清液100 μL，50 ℃氮气吹干，置于60 ℃烘箱烘干，加入20 μL β-苯基葡萄糖苷（0.25 mg/mL，溶于吡啶）。加入200 μL 2.0%盐酸羟氨溶液，70 ℃反应30 min，然后加入衍生剂HMDS＋TMS＋吡啶300 μL，70 ℃反应40 min，以4 ℃、10 000 r/min离心5 min，取上清液待测。

1.3.2 多酚测定

油菜蜜中18 种多酚含量的测定参考文献[19,22-23]方法。称取蜂蜜样本5.0 g，置于50 mL离心管中，加入30 mL盐酸溶液。将离心管置于涡旋仪上彻底溶解后，10 000 r/min离心10 min，取上清液等待固相微萃取。首先用甲醇和盐酸溶液活化Oasis HLB固相萃取柱，然后将样本上清液倒入已经活化后的Oasis HLB固相萃取柱，随后以纯水清洗萃取柱。清洗结束后以10 mL甲醇洗脱多酚类物质。洗脱液在40 ℃氮吹干，用1.0 mL甲酸-乙腈（7∶3，V/V）混合液溶解。将复溶液0.22 µm滤膜过滤后放入1.5 mL进样瓶中，上机前待测。

1.4 数据处理与分析

每个实验样本都预备3 个平行，3 次测定值差值不超过0.02，以均值作为最后分析数据。利用SPSS v.17.0软件进行数据分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）[24]。数据服从于正态分布且齐次，单因素方差分析被用于研究不同产地油菜蜜低聚糖和多酚含量的显著性差异，在α=0.05的置信区间服从Duncan检测，数据分析的结果以 ±s的形式表示。利用PCA不同参数的载荷因子得分率，并利用Origin v.8.5软件绘制柱形图。利用SIMCA v.17.0软件进行PLS-DA[25]。

2 结果与分析

2.1 低聚糖含量分析

油菜蜜中含有多种低聚糖物质，对ZX、YC、GC 3 个产地油菜蜜中含量较高的麦芽酮糖、松二糖、帕拉金糖、异麦芽糖、蔗果三糖、吡喃基葡蔗糖6 种低聚糖进行研究。由表2可知，ZX、YC、GC 3 个产地的油菜蜜样本中6 种低聚糖含量均显示：松二糖＞麦芽酮糖＞异麦芽糖＞帕拉金糖＞蔗果三糖＞吡喃基葡蔗糖。本实验研究结果显示油菜蜜中6 种功能性低聚糖，松二糖的含量最高，ZX、YC、 GC 3 个产地样本中的质量分数分别为（1.251±0.05）%、（1.344±0.03）%、（2.505±0.07）%、（0.027±0）%、（0.026±0.01）%、（0.128±0）%；吡喃基葡蔗糖的含量相对偏低，分别为（0.027±0）%、（0.026±0.01）%、（0.128±0）%。其次，3 个地区油菜蜜中的低聚糖含量存在一定差异，吡喃基葡蔗糖的含量为GC＞ZX＞YC；麦芽酮糖、松二糖、帕拉金糖、异麦芽糖、蔗果三糖5 种低聚糖的含量为GC＞YC＞ZX。单因素方差分析的结果显示：麦芽酮糖、帕拉金糖、异麦芽糖、蔗果三糖、吡喃基葡蔗糖5 种低聚糖，GC与ZX、YC差异显著，ZX与YC差异不显著；ZX、YC、GC的松二糖含量差异显著。

表2 不同产地油菜蜜中低聚糖的方差分析Table 2 ANOVA of oligosaccharide contents of rape honey from different geographical origins%

2.2 多酚含量分析

本研究通过对油菜蜜中含量较高的18 种多酚类物质进行产地差异性研究分析。酚酸物质分别包括：没食子酸、原儿茶酸、羟甲基苯甲酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、苯甲酸、杨梅酮、桑色素、槲皮素、柚皮苷、芹菜素、山柰酚、柯因、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯。由表3可知，不同的多酚物质其含量在油菜蜜中差异较大，3 个产地油菜蜜中18 种多酚类物质含量的测定结果显示：对羟基苯甲酸＞苯甲酸＞咖啡酸＞松属素＞柯因＞山柰酚＞原儿茶酸＞槲皮素＞芦丁＞柚皮苷＞咖啡酸苯乙酯＞高良姜素＞阿魏酸＞桑色素＞芹菜素＞没食子酸＞杨梅酮。ZX、YC和GC 3 个产地的油菜蜜样本中对羟基苯甲酸的含量最高，分别可达到（68.172±2.76）、（46.22±1.7）、（55.701±0.83）μg/100 g；其次是苯甲酸的含量，分别可达到（55.658±0.91）、（40.283±1.78）、（31.137±1.2）μg/100 g；此外，油菜蜜的18 种多酚类物质含量最低的有芹菜素、没食子酸、杨梅酮等。3 个地区油菜蜜样本中芹菜素含量分别为（0.161±0.01）、（0.019±0）、（0.113±0.01）μg/100 g；没食子酸含量分别为（0.14±0.01）、（0.117±0.01）、（0.108±0）μg/100 g；杨梅酮含量分别为（0.034±0）、（0.013±0.01）、（0.024±0）μg/100 g。

ZX、YC和GC 3 个地区油菜蜜中多酚的单因素方差分析结果显示：油菜蜜中原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、杨梅酮、槲皮素、柚皮苷、芹菜素、山柰酚、柯因、松属素的多酚含量，不同产地间存在显著差异性；没食子酸和芦丁的含量，青海与湖北、江苏存在显著性差异，ZX与YC无显著性差异；咖啡酸含量，YC与ZX、GC存在显著性差异，ZX与GC无显著性差异；桑色素、高良姜素，ZX与YC、GC存在显著性差异，YC与GC无显著性差异。综合而言，本研究中ZX的多酚类物质含量略高于YC、GC。

2.3 PCA结果

图1 PCA的载荷因子得分图Fig. 1 Loading plots of principal component analysis

PCA是一种无监督分析模式，目前广泛应用于食品、化学、生物、数理统计分析等研究领域[26]。本实验利用SPSS软件对湖北、江苏、青海3 个产地油菜蜜中6 种低聚糖和18 种多酚类物质进行PCA研究。PCA中累积贡献率越高则，说明其对于不同产地油菜蜜的鉴别程度越高[27]。本研究中前两个主成分特征根值大于1，PC1、PC2、PC3贡献率分别为55.51%、21.80%、3.99%，前3 个主成分的累积贡献率达到81.3%。图1显示，PC1中多酚类物质全部都为正值，其中原儿茶酸、松属素、桑色素、槲皮素、柚皮苷、柯因最具有地理判别特征性。PC2中咖啡酸、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、吡喃基葡蔗糖、阿魏酸、麦芽酮糖、松二糖、蔗果三糖的地理特征性最为显著，其中没食子酸、对香豆酸、苯甲酸、柚皮苷4 种酚酸类物质均为负相关性。低聚糖对于PC1无贡献率，在PC2中低聚糖的贡献率较高。综合而言，在产地判别率中，多酚类物质的产地判别能力较为显著。同时，低聚糖也是一个重要的辅助参数。

2.4 PLS-DA结果

图2 油菜蜜中PLS-DA产地溯源模型得分图Fig. 2 PLS-DA score plot for geographical traceability of rape honey

本实验采用油菜蜜中低聚糖和多酚总计24 个参数结合PLS-DA对ZX、YC和GC 3 个不同地理来源的油菜蜜样本进行产地鉴别研究。由图2可知，湖北、江苏、青海3 个地区的油菜蜜样本完全分离，分类效果非常好；且样本分布集中，鉴别率均为100%。PLS-DA模型潜变量1的R2X（自变量拟合指数）、R2Y（因变量拟合指数）、Q2（模型预测精度）以及特征根值分别为0.553、0.497、0.493、13.3；潜变量2的R2X、R2Y、Q2以及特征根值分别为0.773、0.975、0.97、5.29；潜变量3的R2X、R2Y、Q2以及特征根值分别为0.798、0.981、0.967、0.603。根据R2X、R2Y、Q2以及特征根值的分析，建立PLS-DA溯源模型的潜变量个数为2，该模型的产地识别预测精度可达到最高97%且内部交叉验证均方差为0.08，PLS-DA溯源模型的判别结果非常准确且稳定。

图3 油菜蜜中PLS-DA产地溯源模型VIP图Fig. 3 PLS-DA VIP plot for geographical traceability of rape honey

本研究的PLS-DA模型选定的潜变量个数为2，一般而言潜变量1对于整个模型的贡献率最高，但为更加详细的显示各参数的重要性[28]，因此图3将3 个潜变量的变量投影重要度（variable importance in the project，VIP）值全部展示出（3 个潜变量中VIP值均小于1的参数则不展示）。VIP值大于1则表示该参数属于产地鉴定中重要的标记指标，而VIP值小于0.5则表示该参数对于鉴定结果不重要[29]。由此可知，在潜变量1中对于产地判别占据重要影响作用的指标主要有对香豆酸、柚皮苷、原儿茶酸等16 种多酚，而低聚糖中仅松二糖、吡喃基葡蔗糖的VIP值大于1。其次，潜变量2和潜变量3的VIP图中各参数重要性基本一致，对于产地判别重要性影响提供贡献率最高的参数均是咖啡酸，最不重要的参数均为没食子酸。低聚糖对于潜变量2、3中显示为重要的参数与潜变量1对比，增加了麦芽酮糖与蔗果三糖。异麦芽糖与蔗果三糖，在3 个潜变量中均介于重要与不重要之间的灰色区域。

3 结 论

本研究对ZX、YC和GC 3 个完全不同的气候和地理环境，油菜蜜样本中低聚糖和多酚含量进行差异性研究分析。方差分析结果显示6 种低聚糖和18 种多酚类物质均存在一定的地理差异性。采用PCA对具有显著贡献率的参数进行分析，研究发现对香豆酸、柚皮苷、原儿茶酸、咖啡酸等具有显著的地理特征性。而PLS-DA模型的研究结果显示，3 个地方的判别正确率均为100%，无任何误判样本出现。同时，该模型留一法交叉验证结果显示其预测准确率可达到97%，模型具有非常好的稳定性和准确度。综上可知，低聚糖和多酚结合PLS-DA技术对于不同地理来源油菜蜜的鉴别具有极大的研究价值和参考意义。