菊粉对冻藏鲢鱼鱼糜肌原纤维蛋白抗冻性的影响

仪淑敏，叶贝贝，张诗雯，余永名，赵文浩，李学鹏，范大明，郁晓君，丁浩宸，黄建联，徐永霞，米红波，励建荣,*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁省高等学校生鲜食品产业技术研究院，辽宁 锦州 121013；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；3.辽宁安井食品有限公司，辽宁 鞍山 114100）

冷冻鱼糜，又称生鱼糜，是指在采肉、漂洗、精滤之后的鱼肉中加入抗冻剂，再经搅拌均匀后冻结的鱼肉。随着淡水鱼养殖产量的增加以及海洋渔业资源的不断减少，淡水鱼逐渐成为加工鱼糜的主要原料之一。2016年，全国鱼糜制品总产量达到155.36万 t[1]，其中鲢鱼作为我国年产量仅次于草鱼的第二大鱼类，具有肉质鲜美、营养丰富、繁殖迅速、产量高等优点，因此逐渐受到了水产品加工企业的青睐[2]。

冷冻贮藏是目前保存鱼糜最常用的方法[3]，抗冻剂的添加是为了防止和延缓冻藏过程中鱼糜肌原纤维蛋白的变性，从而延长鱼糜的贮藏期。商业上常用的抗冻剂是蔗糖和山梨醇的混合物，尽管二者抑制鱼肉蛋白冷冻变性的效果显著，但其高甜、高热量的特性影响了产品的营养价值。因此，低糖低热量的新型抗冻剂的研究逐渐成为一种趋势。

现阶段新型抗冻剂种类繁多，糖是其中的一大类，糖类的冷冻保护机制可能有以下3 种：一是在冷冻体系中形成的玻璃体，抑制了蛋白的聚集；二是与蛋白质分子周围的水分子优先结合；三是与蛋白质分子氢键的结合[4]。专家学者对糖类抗冻剂进行的研究表明，海藻糖能抑制草鱼鱼糜蛋白在冷冻过程中的变性，延缓鱼糜冻藏品质的下降，同时对罗非鱼鱼糜肌原纤维蛋白也具有一定的抗冻效果[5-6]。

菊粉是一种可溶性的膳食纤维，它是果糖通过β-2,1糖苷键聚合而成的线性直链多糖，其分子末端连接一个葡萄糖残基，聚合度在2～60之间，易溶于水，略带甜味，甜度只有蔗糖的30%～40%[7]。菊粉作为食品和营养的增补剂，被用于各种食品中，具有改善质构、减少热量等作用，它可以代替脂肪和糖类，成为低卡路里的填充剂，也可以作为一种保水剂[8]。除此之外，菊粉可作为蛋白保护剂[9]，减少蛋白质的变性，而且在冻藏过程中起到稳定蛋白质构象的作用，还可能起到减少冰晶生成的作用[10-11]，如菊粉可作为菌种保藏抗冻剂的主要成分之一，用于对细胞和蛋白的保护[12]。菊粉与蔗糖、果糖等大多数糖类抗冻剂不同，它是不易消化的碳水化合物，因此，对血糖的影响极小，适合糖尿病患者使用；另外，菊粉在冷冻干燥过程中稳定蛋白质的能力比海藻糖更好[13]。本实验将菊粉加入冷冻鲢鱼鱼糜中，旨在探究菊粉对鲢鱼鱼糜蛋白在冻藏过程中的保护作用，以期寻找一种低糖低热量的抗冻保护剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲢鱼 锦州市水产市场；菊粉（食品级，平均聚合度26） 陕西慈缘生物技术有限公司；食盐锦州市大润发超市；蔗糖、山梨醇（食品级） 河南中泰食化有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、酒石酸钾钠、氢氧化钠、硫酸铜、Tris、氯化钾、盐酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、尿素、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、8-苯胺基-1-萘磺酸铵（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS）（均为分析纯） 天津市天力化学试剂有限公司；ATP酶测试盒 南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

YC200采肉机和精滤机 诸城市凯成良才食品机械厂；T78-90樱花牌脱水机 慈溪樱花电器有限公司；ZB-20型数显恒温水浴锅 诸城市瑞恒食品机械厂；AF-10全自动雪花制冰机 斯科茨曼制冰机系统（上海）有限公司；MS105DU分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；IKA-T25均质机 德国IKA公司；SORVALL STRATOS型冷冻高速离心机 德国Sigma公司；精密pH计 美国Mettler-Toledo公司；UV-2550紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；970CRT荧光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

新鲜鲢鱼→前处理（去头、去鳞、去内脏）→采肉→用清水漂洗2 次→0.15%盐水漂洗1 次→脱水（控制水分质量分数为78%）→精滤→空斩得鲢鱼鱼糜

将鲢鱼鱼糜按抗冻剂的添加分为6 组，分别为：空白组（0%菊粉）、添加0.5%菊粉、添加1.0%菊粉、添加1.5%菊粉、添加2.0%菊粉和添加商业抗冻剂（4.0%蔗糖＋4.0%山梨醇）。将各组样品冻藏于－18 ℃条件下，定期取样测定指标。

1.3.2 肌原纤维蛋白的提取

根据Kunihiko等[14]的方法稍作修改。称取20 g鱼糜，加入5 倍体积的含0.1 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）提取液，6 000 r/min匀浆，每匀浆30 s停30 s，重复5 次，整个匀浆过程混合液置于冰浴中。匀浆液于4 ℃、10 000×g离心20 min，去除上清液，沉淀再用5 倍上述提取液重复3 次。最后得到的沉淀用0.6 mol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 7）提取液溶解，匀浆后于4 ℃静置提取1 h，离心得到上清液，即为肌原纤维蛋白溶液。

1.3.3 盐溶性蛋白含量的测定

根据Xiong Guangquan等[15]的方法稍作修改。提取不同冻藏时间的肌原纤维蛋白，将其用蒸馏水稀释至2 mg/mL，在4 ℃、5 000×g离心15 min，取上清液，测定其质量浓度。盐溶性蛋白含量为提取的不同冻藏时间肌原纤维蛋白离心后上清液的蛋白质量浓度和初始肌原纤维蛋白质量浓度的比值，按照下式计算：

1.3.4 Ca2＋-ATPase活性的测定

将提取出来的肌原纤维蛋白溶液用0.6 mol/L、pH 7.0的KCl溶液稀释至5 mg/mL后，采用ATP酶测试盒测定。150 μL肌原纤维蛋白（5 mg/mL）与试剂盒试剂混合后37 ℃反应10 min，再通过试剂盒试剂终止反应，将混合液3 500×g离心5 min后取上清液，取150 μL上清液与试剂盒试剂混合后45 ℃反应20 min，取出冷却至室温，660 nm波长处测定吸光度。肌原纤维蛋白Ca2＋-ATPase活性表示为单位时间内单位蛋白质释放的无机磷物质的量，单位μmol/（mg·min）。

1.3.5 总巯基和活性巯基含量的测定

根据Zhou Aimei等[16]的方法稍作修改。提取出的肌原纤维蛋白溶液用0.6 mol/L、pH 7.0的KCl稀释至5 mg/mL。总巯基的测定：取此溶液0.5 mL，加入4.5 mL 0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH 6.8，含8 mol/L尿素、2% SDS和10 mmo1/L EDTA），混匀后取4 mL加入0.4 mL 0.1%的DTNB溶液（0.2 mol/L Tris-HCl，pH 6.8），在40 ℃反应25 min后用紫外-可见分光光度计于412 nm波长处测吸光度，用0.6 mol/L、pH 7.0的KCl溶液同时做一空白实验。活性巯基的测定在不添加尿素的情况下进行。总巯基含量和活性巯基以蛋白质计，单位mo1/105g，其中分子消光系数取13 600 L/（mol·cm）。

1.3.6 表面疏水性的测定

根据Benjakul等[17]的方法稍作修改。将提取出的肌原纤维蛋白以10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0，含0.6 mol/L NaCl）稀释成0、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL系列质量浓度，体积均为4 mL，在20 ℃水浴10 min，加入20 μL 8 mmol/L ANS的0.1 mol/L磷酸盐溶液（pH 7.0），反应完后在激发波长374 nm、发射波长485 nm条件下，用荧光分光光度计测定其荧光强度，表面疏水性以荧光强度与肌动球蛋白质量浓度对应的曲线斜率表示。

1.4 统计分析

实验数据采用SPSS 19.0软件进行分析处理，利用Origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 菊粉对鲢鱼鱼糜盐溶性蛋白含量的影响

肌原纤维蛋白是一种盐溶性蛋白，其含量是蛋白质变性的一个重要指标，反映了肌球蛋白杆部的变化趋势。在冻藏过程中，肌原纤维蛋白变性会导致氢键、疏水相互作用、二硫键和离子相互作用的形成，从而其盐溶性会下降[18-19]。

图1 添加菊粉的鲢鱼鱼糜盐溶性蛋白含量的变化Fig. 1 Change in salt extractable protein content of sliver carp surimi with added inulin

由图1可知，空白组、添加商业抗冻剂和不同比例菊粉的实验组在冻藏5 周过程中盐溶性蛋白含量均呈现下降趋势，冻藏5 周后，添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%菊粉实验组和添加商业抗冻剂实验组的盐溶性蛋白含量分别下降了54.91%、45.16%、33.88%、27.18%、36.08%和22.98%，其中空白组的下降幅度最大，添加商业抗冻剂后下降幅度最小，添加1.5%菊粉实验组较不添加和添加其他比例菊粉的盐溶性蛋白含量下降程度小。添加2%菊粉实验组的抗冻效果开始下降，原因可能是添加过量的菊粉等糖类抗冻剂，使抗冻剂和蛋白质的比例过高，导致抗冻剂的结晶和失稳，消除了其对蛋白质的保护作用[20]。米顺利等[21]研究表明，海藻糖也能够明显抑制罗非鱼鱼糜盐溶性蛋白在冻藏过程中的降低。Zhou Aimei等[22]实验结果发现，在25 周的冻藏过程中，8%的海藻糖控制盐溶性蛋白下降的效果比商业抗冻剂要好。由此可知，虽然各组样品在冻藏期间均出现了蛋白质的冷冻变性，但是1.5%菊粉能较好的抑制盐溶性蛋白含量的下降，具有一定的抗冻性。

2.2 菊粉对鲢鱼鱼糜肌原纤维蛋白Ca2＋-ATPase活性的影响

鱼肉肌球蛋白头部具有Ca2＋-ATP活性，可以反映肌球蛋白的完整性，也被广泛地作为反映鱼肉或鱼糜蛋白变性的常用指标之一[23]。鱼肉在冻藏过程中，蛋白中氢键、疏水键、二硫键和离子键的改变会导致蛋白结构变化，尤其是肌球蛋白头部，从而使蛋白固有的酶活性降低[24]。

由图2可知，空白组、添加商业抗冻剂和不同比例菊粉的实验组在冻藏5 周过程中肌原纤维蛋白Ca2＋-ATPase活性均呈现下降趋势，冻藏5 周后，添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%菊粉实验组和添加商业抗冻剂实验组的Ca2＋-ATPase活性分别下降了87.13%、77.81%、65.83%、63.02%、75.00%和58.43%，其中空白组的下降速度最快，添加商业抗冻剂实验组下降速度最慢，添加1.5%菊粉实验组的Ca2＋-ATPase活性比不添加和添加其他比例菊粉实验组的下降速度慢。其他学者也得到了相似的结论，刘安军等[25]研究发现，4%聚葡萄糖作为抗冻剂可以明显抑制鳙鱼鱼糜的肌原纤维蛋白Ca2＋-ATPase活性的下降。Xiong Guangquan等[15]研究表明1%的魔芋葡甘聚糖可以减轻Ca2＋-ATPase活性的降低，对草鱼肌原纤维蛋白有较好的冷冻保护作用。冻藏过程中，冰晶的形成会改变肌球蛋白的头部结构，从而导致Ca2＋-ATPase活性降低，菊粉等糖类抗冻剂会使冰晶的形成受阻，从而降低Ca2＋-ATP活性的下降程度[26]。由上述结果可知，不同比例的菊粉作为糖类抗冻剂均能起到抑制Ca2＋-ATPase活性降低的作用，其中1.5%的菊粉效果更明显，效果更接近商业抗冻剂。

图2 添加菊粉的鲢鱼鱼糜肌原纤维蛋白Ca -ATPase活性的变化Fig. 2 Change in Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein from sliver carp surimi with added inulin

2.3 菊粉对鲢鱼鱼糜肌原纤维蛋白总巯基和活性巯基含量的影响

巯基作为肌原纤维蛋白中最具反应活性的功能基团[27]，其数量对于蛋白结构的稳定至关重要。总巯基包括活性巯基和隐藏的巯基，分别存在于肌球蛋白头部和轻链酶解肌球蛋白部分[28]，也有一部分隐藏于肌球蛋白内部。在冻藏或冻融过程中，蛋白结构变化会导致巯基的位置发生改变，埋藏在蛋白结构内部的巯基可能暴露于蛋白表面，半胱氨酸上的巯基发生氧化或二硫键的交换反应导致二硫键的形成[29]，活性巯基更易氧化成二硫键，因此蛋白质冷冻变性往往会使其总巯基和活性巯基的含量减少。

图3 添加菊粉的鲢鱼鱼糜肌原纤维蛋白总巯基含量的变化Fig. 3 Change in total sulfhydryl content of myofibrillar protein from sliver carp surimi with added inulin

由图3可知，空白组、添加商业抗冻剂和不同比例菊粉的实验组在冻藏5 周过程中总巯基含量均呈现下降趋势，冻藏5 周后，添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%菊粉实验组和添加商业抗冻剂实验组的总巯基分别下降了61.06%、47.91%、37.53%、33.96%、38.74%和31.09%。

图4 添加菊粉的鲢鱼鱼糜肌原纤维蛋白活性巯基含量的变化Fig. 4 Change in surface-reactive sulfhydryl content of myofibrillar protein from sliver carp surimi with added inulin

图4 表明，活性巯基呈现总巯基相同的变化趋势，冻藏5 周后，实验组的活性巯基分别下降了61.65%、39.50%、37.84%、33.79%、39.26%和30.22%。王宁等[30]研究表明海藻糖可以抑制大黄花鱼肌原纤维蛋白总巯基和活性巯基的下降，Nopianti等[31]也发现聚葡萄糖对金线鱼的总巯基和活性巯基有抑制下降的作用。在冻藏过程中，形成的冰晶会使肌原纤维蛋白结构发生改变，埋藏在分子内部的巯基暴露，被氧化形成二硫键，导致巯基的减少，菊粉等糖类抗冻剂对冰晶的形成有抑制作用，降低了巯基的下降速度，与图2的Ca2＋-ATPase活性的变化趋势相同[32]。从总巯基和活性巯基含量的变化情况可知，菊粉能有效抑制总巯基和活性巯基含量的下降，其中1.5%菊粉的抗冻效果优良，能很大程度上抑制蛋白质的变性，起到保护肌原纤维蛋白的作用。

2.4 菊粉对鲢鱼鱼糜肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

表面疏水性可以有效地反映蛋白质结构的微小变化。新鲜鱼糜蛋白的疏水性氨基酸残基一般位于蛋白质分子内部，具有较低的表面疏水性，而在冻藏过程中，蛋白质可因变性而发生构型转化，使原先位于蛋白质分子内部的疏水性氨基酸残基暴露并发生氧化，从而导致蛋白质表面疏水性增加[33-34]。

由图5可知，空白组、添加商业抗冻剂和不同比例菊粉的实验组在冻藏5 周过程中表面疏水性均呈现上升趋势，冻藏5 周后，添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%菊粉实验组和添加商业抗冻剂实验组的表面疏水性分别上升了844.78%、810.28%、665.11%、605.67%、740.07%和542.74%。上述结果表明，添加抗冻剂后，冻藏鲢鱼鱼糜肌原纤维蛋白表面疏水性的增加得到明显的抑制，周爱梅等[35]研究表明，8%海藻糖和8%聚葡萄糖也能抑制鲮鱼鱼糜蛋白表面疏水性，具有一定的抗冻性。本实验中，菊粉对鲢鱼鱼糜肌原纤维蛋白保护效果较好，可能是因为菊粉等糖类抗冻剂通过与蛋白质反应基结合，使处于饱和状态的蛋白质分子难以聚集变性；另一方面，糖类抗冻剂含有的游离羟基，与水分子结合，导致“共晶点”温度的降低，减缓冰晶的形成[36-37]。由此可知，菊粉等糖类抗冻剂的加入可在很大程度上稳定蛋白的结构，在添加不同比例的菊粉实验中，1.5%的菊粉最能起到商业抗冻剂类似的效果。

图5 添加菊粉的鲢鱼鱼糜肌原纤维蛋白表面疏水性的变化Fig. 5 Change in surface hydrophobicity of myofibrillar protein from sliver carp surimi with added inulin

3 结 论

1.5 %菊粉对冻藏的鲢鱼鱼糜能起到较好的抗冻效果，冻藏5 周后，其盐溶蛋白含量、Ca2＋-ATPase活性、总巯基含量和活性巯基含量分别下降了27.18%、63.02%、33.96%、33.79%；表面疏水性上升了263.89。商业抗冻剂的盐溶蛋白含量、Ca2＋-ATPase活性、总巯基含量和活性巯基含量分别下降了22.98%、58.43%、31.09%和30.22%，表面疏水性上升了236.47。1.5%菊粉效果更接近商业抗冻剂，可作为一种低热低甜度的新型抗冻剂进行下一步的开发。