花青素共价交联大豆蛋白对其结构及营养吸收特性的影响

刘英杰，蒋 悦，黄 国，王 宁，刘春峰，王天雪，李 婧，刘贵辰，隋晓楠，江连洲*

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

蛋白质是一种具有特定空间结构的生物大分子，含有20 种不同的氨基酸，是人体必需的重要营养成分之一。一直以来，人们日常摄入蛋白质的来源主要是动物蛋白和植物蛋白。然而，近年来动物蛋白在人们膳食中的利用越来越受到研究学者们的质疑，研究表明无论从环境保护、饮食可持续发展还是人类健康角度出发，人类饮食中植物蛋白代替动物蛋白都是一个明智的选择[1-4]。大豆蛋白作为一种重要的全价蛋白，其成本低廉，营养丰富，是为数不多可替代动物蛋白的优质植物蛋白[5]。

除植物蛋白外，多酚类物质也是人们日常饮食中重要的营养成分[6]。花青素是一种常见的水溶性类黄酮物质，属于多酚，其广泛存在于蔬菜、水果、谷物及饮料等食物中，具有抗氧化、抗病菌、增强免疫力、抗炎症的生理活性[7-10]。

多酚类物质分子比较小，对蛋白具有天然的亲和力，可与蛋白发生非共价（疏水相互作用、氢键、离子作用等）或共价互作。共价互作一般发生在碱性条件或多酚氧化酶存在条件下，多酚被氧化成醌后，可与蛋白多肽链上的氨基酸残基生成稳定的化学键（C—N/C—S键）进而形成蛋白-多酚共价复合物。食品中蛋白与多酚的相互作用会不可避免的影响食品的口感，功能及吸收等特性[11-12]。因此，对蛋白与多酚互作的充分探究有益于实现蛋白在食品中的最大利用价值。

已经有部分文献对蛋白与多酚的共价互作进行探究，例如牛血清白蛋白与槲皮素[13]、明胶与儿茶素[14-15]、牛血清白蛋白与儿茶素[16]、牛奶蛋白与类黄酮[17]、绿原酸与α-乳白蛋白[18]等。研究表明多酚对蛋白的共价交联会影响蛋白的结构、功能及营养特性。但是不同种类的多酚对不同种类蛋白特性的影响有差异，且同一食品基质中，多酚与蛋白的不同共价交联方式也会不同程度地影响蛋白特性[19]。目前本课题组已经对花青素与SPI在碱性条件下交联的共价复合物进行了部分结构和功能的探究[7,20-21]，但是关于花青素与SPI共价复合物在人体消化中的功能性及营养性的研究尚存不足，两者共价复合物的浓度与其分子结构及营养吸收特性的规律也没有得到明确解析，花青素与SPI的不同共价交联条件（碱性或多酚氧化酶）对其复合物相关性质影响的探究更是留有空白。

由此，本实验选用不同质量浓度的花青素与SPI分别在不同共价交联条件（碱性或漆酶）下互作以形成花青素-SPI共价复合物，并将之进行体外模拟胃肠消化，后用Caco-2细胞模型对其肠道消化产物进行模拟人体小肠吸收，进而探究花青素共价交联后的SPI分子结构及营养吸收特性。本研究为花青素与SPI复合产品在食品中的合理应用研究提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花青素黑米提取物 中国山西天之润生物科技有限公司；大豆 市售；大豆分离蛋白由实验室自制；漆酶河北仟盛生物科技有限公司；猪胆盐 北京索莱宝科技有限公司；甲酸、乙腈（均为色谱纯）、胃蛋白酶（600 U/mg）、胰液素、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 美国Sigma公司；正己烷、乙酸乙酯、甲醇、邻苯二甲醛（o-phthalaldhyde，OPA）、盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸铵北京新光化工试剂厂；Caco-2细胞 美国ATCC生物生物标准品资源中心；胎牛血清、DMEM培养基 美国Gibco BRL公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

GL-25MS超速高速冷冻离心机 上海盛析仪器设备有限公司；恒温水浴振荡摇床 常州恩培仪器制造有限公司；WAT023635高效液相色谱仪 美国Waters公司；Sunfire C18反向色谱柱（250 mm×4.6 mm）美国Waters公司；旋转蒸发仪 上海皖宁精密科学仪器有限公司；F-4500型荧光分光光度计 日本Hitachi公司；PHS-25型酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司；Tecan Infinite 200 Pro酶标仪 瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制备

参考Wu Longkun等[22]的制备方法。将脱脂豆粉溶解于去离子水（1∶20（g/mL））后，用2 mol/L的NaOH溶液将混合溶液的pH值调节至8并搅拌2 h。将其悬浮液离心30 min（4 ℃、10 000×g）后取上清液，用2 mol/L的HCl溶液调节pH值至4.5后静置1 h。将混合物离心20 min（4 ℃、6 000×g）得到蛋白沉淀，用去离子水水洗沉淀3 次后溶解，用2 mol/L的NaOH溶液调节蛋白溶液pH值中性，将此中性蛋白溶液冷冻干燥后即可得到SPI。

1.3.2 花青素的提纯与定量

参考Sui Xiaonan等[23]的方法，将花青素黑米提取物按照1∶100（g/mL）比例溶解于去离子水中，减压抽滤。收集滤液并对其进行固相萃取，参考以下程序：将滤液、2 倍柱体积的酸化水、2 倍柱体积的乙酸乙酯溶液、4 倍柱体积酸化的甲醇溶液依次通过固相萃取柱。收集此花青素甲醇溶液，对其进行旋转蒸发去除甲醇后即可得到花青素纯化物。花青素纯化物在520 nm波长处用高效液相色谱进行定量。梯度洗脱条件根据Sui Xiaonan等[23]的方法，流量为1 mL/min，温度为25 ℃。同时本实验统一使用矢车菊素-3-葡萄糖苷（花青素黑米提取物中主要成分）质量浓度为花青素质量浓度。

1.3.3 花青素与SPI共价复合物的制备

参考Prigent等[18]的方法并稍作修改。将SPI粉末以1∶100（g/mL）比例溶解于0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7）中，添加不同质量浓度（0.17、0.25、0.5 g/L）的花青素后，加入漆酶（0.2 U/mL）避光搅拌24 h，并依次标记为LC1、LC2、LC3。

参照Rohn等[24]的方法，将SPI粉末以1∶100（g/mL）比例溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中，添加不同质量浓度（0.17、0.25、0.5 g/L）的花青素后，调节溶液pH值至9.0后避光搅拌24 h，并依次标记为AC1、AC2、AC3。将反应后的6 组样品透析48 h（截留分子质量8～10 kDa），并隔8 h换水一次。冻干透析袋内样品后即可得花青素-SPI共价复合物。

1.3.4 三维荧光光谱分析

将SPI和花青素-SPI共价复合物溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其蛋白质量浓度为0.2 mg/mL。取样品分别置于石英比色皿中测定。其中，以200 nm为起始激发波长，200～500 nm为连续扫描记录发射波长；增长间隔10 nm，扫描曲线16 条。

1.3.5 体外模拟胃肠消化及消化产物水解度的测定

参考Minekus等[25]的方法稍作修改后对SPI及6 组共价复合物进行体外模拟胃肠消化。将样品分别溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其蛋白含量为50 mg/mL。取样品溶液与模拟胃环境的电解质溶液（6.9 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、47.2 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2·6H2O和0.5 mmol/L(NH4)2CO3）等体积混合后，加入0.3 mol/L CaCl2·2H2O。随后添加一定质量的胃蛋白酶（600 U/mg），使最终消化液中蛋白酶达2 000 U/mL，用1 mol/L HCl溶液调节混合液pH值至3，上述样品溶液及试剂在混合前均需在37 ℃条件下预热30 min。将配制好的混合液置于水浴振荡摇床中（37 ℃、170 r/min）进行胃部消化反应，2 h后用0.5 mol/L NaHCO3溶液将消化液pH值调至中性后结束胃部消化，期间实时监控pH值为3。胃部消化反应结束后取一定量的消化产物离心取上清液，进行蛋白质水解度测定。

取一定体积的胃部消化产物溶液与模拟肠部环境的电解质溶液（6.8 mmol/L KCl、0.8 mmol/L KH2PO4、85 mmol/L NaHCO3、38.4 mmol/L NaCl和0.33 mmol/L MgCl2·6H2O）以1∶1的比例混合，加入0.3 mol/L CaCl2·2H2O和160 mmol/L的猪胆盐。随后添加一定质量的胰液素，使最终消化液中胰蛋白酶达100 U/mL，用1 mol/L NaOH溶液调节混合液pH值至7，将其置于水浴振荡摇床中（37 ℃，170 r/min）进行小肠消化反应。模拟小肠消化过程中，分别于30、60、90、120、150 min和180 min处进行抽样检测蛋白水解度，各消化终点处采用0 ℃冰浴30 min以结束小肠消化，期间实时监控pH值为7。180 min反应结束后的消化液高速离心取上清液，冷冻干燥得最终消化产物粉末。

1.3.6 蛋白水解度的测定

参考Nielsen等[26]的方法，取一定量的样品溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其含量为10 mg/mL。然后取50 mg丝氨酸标准品溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其浓度为0.951 6 meqv/L（式（1）），以此得到丝氨酸标准液。将400 μL的丝氨酸标准液、样品溶液和PBS（空白）与3 mL OPA试剂混合，2 min后用可见光分光度计在340 nm波长处测定其吸光度。根据以下公式进行水解度计算：

式中：Serine-NH2为每克蛋白丝氨酸氨基物质的量/（mmol/g）；X为样品质量/g；P为样品中的蛋白含量/%；0.1为样品体积/L；α=0.97 meqv/g；β=0.342；htot=7.80；DH为水解度/%。

1.3.7 蛋白多肽浓度的测定

参考Zhu Chaozhi等[27]的方法。称取80 mg OPA溶解于2 mL甲醇中，将其完全溶解后与50 mL四硼酸钠（100 mmol/L）溶液，1 mL的β-巯基乙醇及5 mL，20%的十二烷基硫酸钠溶液混合得到OPA试剂。随后将最终消化产物粉末溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其消化产物含量为0.5 mg/mL。取200 μL的消化产物溶液或梯度质量浓度的酪蛋白胰蛋白胨溶液（0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/μL）与4 mL的OPA试剂混合，2 min后取其混合液在340 nm波长处测定吸光度，其中以PBS溶液为空白。根据酪蛋白胰蛋白胨溶液标准曲线计算消化产物多肽浓度。

1.3.8 DPPH法抗氧化能力的测定

参考Sui Xiaonan等[28]的方法并稍作修改。将SPI、花青素-SPI共价复合物，最终消化产物粉末及不同浓度的Trolox分别溶于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中使其质量浓度为5 mg/mL，取配制好的样品溶液100 μL与100 μL的DPPH溶液混合，黑暗条件下放置30 min后在517 nm波长处用酶标仪测定吸光度。其中以PBS溶液为空白，以Trolox当量（nmol/mg）计算样品抗氧化的能力（以吸光度（y）和Trolox浓度（x）制作标准曲线，得到回归方程：y=－49.209x＋0.074 5，R2=0.99）。

1.3.9 ABTS法抗氧化能力的测定

参考Sui Xiaonan等[28]的方法并稍作修改。称取0.38 g ABTS和0.067 g过硫酸钾溶解于PBS（0.01 mol/L，pH 7）中，混合后黑暗条件下放置12～16 h得到ABTS储备溶液。将ABTS储备溶液用0.01 mol/L PBS（pH 7.0）稀释至在734 nm波长处吸光度读数为0.70±0.02后，与上述DPPH测定时的样品溶液等体积混合，黑暗条件下放置7 min。随后在734 nm波长处用酶标仪测定吸光度。其中以PBS溶液为空白，以Trolox当量（nmol/mg）计算样品抗氧化的能力（y=－178.34x＋0.325 2，R2=0.99）。

1.3.10 跨上皮细胞运输及多肽渗透率的测定

参考Zhang Qiaozhi等[29]的方法，Caco-2细胞采用DMEM完全培养基（10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 U/mL青霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺和100 μg/mL链霉素）于25 cm2带盖透气斜口培养瓶中，在无菌培养箱（37 ℃、5% CO2）孵育。对数期生长的细胞通过胰蛋白酶消化法（0.5%胰蛋白酶和0.05% EDTA）传代培养，培养基每隔1 d更换1 次。实验中使用的细胞介于传代20～30之间。

对于样品跨上皮细胞运输实验，Caco-2细胞密度达到4.5×105cells/cm2接种于6 孔细胞养板中，培养基每隔1 d更换1 次。4 d后单层Caco-2细胞融合，分化21 d后选取电阻值高于300 Ω·cm2的Caco-2单层细胞用于跨上皮细胞运输实验。在实验之前，期间和之后需检查单层的完整性，电阻值在300 Ω·cm2附近保持稳定，并且在与样品孵育后未观察到减少的细胞即为合格细胞。用Hank's平衡盐溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）冲洗选择的Caco-2单层细胞两次，并进一步在37 ℃用HBSS平衡30 min。随后取出Caco-2单层细胞，取1.5 mL HBSS置于细胞下室，将最终消化产物粉末溶于HBSS中使其质量浓度为1 mg/mL并取0.5 mL置于细胞上室，同等体积的HBSS代替最终消化产物溶液作为空白。Caco-2单层细胞在37 ℃和5% CO2条件下孵育2 h后。测量细胞上室和下室的多肽浓度，多肽渗透率的计算参考公式（4）：

1.4 数据统计及分析

每组数据重复3 次，利用Origin 8.0软件处理数据作图。利用SPSS 22.0软件进行ANOVA差异显著性分析及相关性分析（P＜0.05，差异显著）。

2 结果与分析

2.1 三维荧光光谱分析

图1 SPI和花青素-SPI共价复合物的三维荧光光谱图Fig. 1 Three dimensional fluorescence spectra of SPI and anthocyanins-SPI conjugates

三维荧光光谱是一种研究蛋白质三级结构的有效手段[30]。图1展示了SPI和花青素-SPI共价复合物的三维荧光光谱图。图中峰a（λex= λem）表示拉曼散射，峰b（λem= 2λex）表示瑞利散射[23]。峰1（λex= 280 nm，λem= 340 nm）主要表示色氨酸和酪氨酸产生的特征峰[23]，如图1所示，花青素共价交联SPI后使蛋白峰1处的荧光值下降，且同一交联条件下，添加的花青素质量浓度与蛋白峰1处的荧光值呈反比。而在同一花青素质量浓度下，漆酶条件交联的花青素-SPI共价复合物比碱性交联的复合物在峰1处的荧光值更低。这表明花青素与SPI在漆酶条件或碱性条件下可发生相互作用，且花青素质量浓度越大，两者的相互作用越强；但是花青素质量浓度相同时，漆酶条件对花青素与SPI的促交联能力强于碱性条件。SPI在峰1处荧光值下降的原因主要是在漆酶或碱性条件下，花青素可被氧化成醌，醌类物质可与蛋白多肽链上的色氨酸或酪氨酸残基发生亲核反应，从而使蛋白色氨酸或酪氨酸处的荧光值下降[31]。相似的研究结果在乳铁蛋白与绿原酸的共价交联中也被发现[32]。此外，图中峰2（λex= 230 nm，λem= 350 nm）主要代表了多肽链骨架结构的特征峰[23]。花青素对SPI共价交联后，蛋白峰2处的荧光值降低，这表明花青素使SPI多肽链发生解折叠从而改变了蛋白的三级结构[33]。同时，由于SPI的三级结构发生改变，使蛋白的色氨酸残基暴露于亲水环境中，从而致使蛋白色氨酸处的荧光值下降，这可能是峰1处荧光值降低的另一个原因。

2.2 水解度分析

图2 SPI和花青素-SPI共价复合物的体外消化水解度Fig. 2 In vitro digestibility of SPI and anthocyanins-SPI conjugates

SPI和花青素-SPI共价复合物在体外模拟胃肠消化过程中的消化性可用蛋白的水解度表示。如图2所示，所有样品的水解度随消化时间的延长而增大，并在模拟小肠消化后期趋于稳定，这主要是因为随消化时间的延长，样品底物浓度增大，酶活减小，消化物经初始阶段积累逐渐趋于恒定等原因造成的[34]。由图2可知，花青素对SPI共价交联使得蛋白在胃肠消化阶段的水解度上升，随着花青素质量浓度的增大，SPI的水解度不断升高。尤其是在漆酶条件下，蛋白水解度远高于碱性条件下交联同质量浓度花青素的SPI和天然SPI的水解度。这可能是由于花青素与SPI的共价交联改变了蛋白的结构，使得蛋白暴露出更多可以被胃蛋白酶或胰蛋白酶水解的位点，从而使得在模拟胃肠消化期间，花青素交联的蛋白水解度增高[35]。

2.3 DPPH法抗氧化能力分析

DPPH法测定样品的抗氧化性是一种常用的方法[12]。图3显示了SPI和花青素-SPI共价复合物在体外模拟胃肠消化前后的抗氧化性。通过DPPH法测定可知，花青素对SPI的共价交联提高了SPI的抗氧化能力，同一交联条件下，花青素-SPI共价复合物的抗氧化能力与花青素的浓度呈正比。就漆酶条件而言，LC1、LC2、LC3的抗氧化能力分别比AC1、AC2、AC3高了9.9%、32.69%、3.29%。众所周知，花青素具有抗氧化能力[28]，因此花青素-SPI抗氧化能力的增加可归因于花青素赋予蛋白的抗氧化能力。而同等花青素质量浓度时，漆酶条件下的花青素-SPI共价复合物抗氧化能力要高于碱性条件下的复合物，这可能由于漆酶对花青素与SPI的促交联能力要高于碱性条件，因此漆酶条件下添加同质量浓度的花青素到SPI时，真正结合在蛋白上的花青素醌数量要多余碱性条件下结合在SPI上的醌。同样，Ali等[12]在碱性条件和多酚氧化酶存在条件下对β-乳球蛋白和咖啡酸进行共价交联，然后对β-乳球蛋白和β-乳球蛋白-咖啡酸共价复合物用DPPH进行抗氧化能力的测定。结果表明：β-乳球蛋白中咖啡酸的引入提高了β-乳球蛋白的抗氧化能力，且多酚氧化酶条件下的共价复合物抗氧化能力要高于碱法条件下的复合物。

图3 SPI和花青素-SPI共价复合物消化前后的抗氧化性（DPPH法）Fig. 3 Antioxidant capacity of SPI and anthocyanins-SPI conjugates before and after digestion as measured by DPPH radical scavenging assay

从图3还可看出，无论是天然SPI还是经花青素共价交联后的SPI，经过胃肠消化后，抗氧化能力都得到提高。这可能要归因于蛋白在消化过程中产生了具有抗氧化性的肽。同样的结果在Rohn等[13]对牛血清白蛋白结合槲皮素的研究中被发现，其研究表明，消化后的牛血清白蛋白-槲皮素共价复合物的抗氧化性高于消化前复合物的抗氧化性。

2.4 ABTS法抗氧化能力分析

图4 SPI和花青素-SPI共价复合物消化前后的抗氧化性（ABTS法）Fig. 4 Antioxidant capacity of SPI and anthocyanins-SPI conjugates before and after digestion as measured by ABTS radical cation scavenging assay

ABTS法是测定样品抗氧化性的另一种常用方法[36]。如图4所示，花青素的添加使SPI的抗氧化性能力增强。相较于SPI的抗氧化性，AC3、LC1、LC2、LC3的抗氧化性都有显著性提升（P＜0.05）。尤其是LC3，抗氧化能力比SPI高出58.72%。这主要是因为花青素本身具有很强的抗氧化性，所以在花青素醌交联到SPI上形成的共价复合物具有抗氧化性。而在漆酶条件下，一定质量浓度的花青素对SPI的亲和力可能高于碱性条件，正如除LC1和AC1外，LC2、LC3的抗氧化性依次高于AC2、AC3。同时，由于SPI被胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后会产生具有抗氧化性的多肽，所以同一样品经过模拟胃肠消化后抗氧化性会升高（图4）。同样，You Juan等[36]在研究卵转铁蛋白和儿茶素的共价相互作用时，也发现卵转铁蛋白的抗氧化性（ABTS法）有所改善。

2.5 多肽渗透率的分析

表1 花青素与大豆分离蛋白共价结合对多肽渗透率的影响Table 1 Effects of covalent conjugation of anthocyanins and SPI on the permeability of SPI-derived peptides

利用Caco-2单层细胞进行多肽运输的实验已经被广泛用于模拟人体小肠对蛋白的吸收[37]。表1展示了SPI和花青素-SPI共价复合物体外胃肠消化结束后产生的多肽的细胞渗透率。相较于天然SPI，共价复合物的多肽渗透率降低。且随着花青素-SPI共价复合物中花青素含量的升高，其复合物产生的多肽细胞渗透率逐渐减小。值得注意的是，添加同质量浓度花青素时，漆酶交联条件下的多肽渗透率降低地更为明显（P＜0.05）。据研究报道，多肽的被动吸收主要依赖于多肽和水形成的氢键。多肽要透过细胞膜，需要足够的能量断开多肽和水之间的氢键[38]。由于花青素是水溶性化合物，因此花青素的共价交联增加了SPI的-OH基团的量，进而增加了花青素-SPI共价复合物与水之间形成氢键的数量，这可能是花青素交联SPI后致使SPI的多肽渗透率降低的原因。而漆酶条件下，添加同质量浓度花青素时，SPI交联的花青素数量比碱性条件下更多，由此带给SPI羟基基团的量更多，多肽与水形成的氢键也越多，断开蛋白多肽与水形成的氢键所需的能量随之增多，从而同等时间内多肽的渗透率越低。然而，由于多肽如何穿过细胞膜的具体机制仍不明晰，所以还需继续探究。

3 结 论

本实验利用花青素在漆酶条件和碱性条件下对SPI进行共价交联，并将其复合物进行体外模拟胃肠消化，探究花青素共价交联SPI后对其分子结构及营养吸收特性的影响。主要结论如下：1）随着花青素质量浓度的增加，花青素-SPI共价复合物的荧光强度逐渐降低，发色基团逐渐被猝灭，多肽链解折叠从而改变了蛋白质的构象。相较于碱性条件，花青素质量浓度相同时，漆酶条件下的花青素-SPI共价复合物荧光猝灭效果更明显。2）花青素对SPI的共价交联提高了蛋白在体外胃肠消化中的水解度，且花青素-SPI共价复合物中花青素含量与复合物水解度呈正比。此外，漆酶条件交联的复合物比碱性条件交联的复合物在体外消化过程中水解度要更高。3）花青素与SPI发生共价相互作用后，蛋白的抗氧化性得到改善。同时，DPPH法和ABTS法都表明，SPI和花青素-SPI共价复合物消化后的抗氧化性比消化前高，而且无论消化前后，样品的抗氧化性都随花青素质量浓度的增加而增强。4）花青素-SPI共价复合物经过体外模拟胃肠消化后产生多肽，其多肽渗透率要低于天然SPI消化后产生的多肽在Caco-2单层细胞的渗透率，而漆酶条件下的多肽渗透率要低于碱性条件下的多肽渗透率。

以上研究结论为花青素在漆酶和碱性条件下交联SPI后，对蛋白结构及营养吸收特性的影响提供部分理论参考价值，为SPI在食品中的合理应用提供理论依据。