高效液相色谱-串联质谱联用法与高效液相色谱法同步测定白玉菇麦角固醇和VD2方法比较

徐明芳，沈林燕，杨云舒，傅利军，孙 勇,*，王洋洋，彭 璐，黄晓晶，李 彦

（1.暨南大学生命科学技术学院，广东 广州 510632；2.北京食品科学研究院，北京 100068）

白玉菇又称白玉蕈、白色真姬菇（white Hypsizigus marmoreus），是真姬菇（H. marmoreus）的一个白色变种，隶属担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（Agaicales），白蘑科（Tricholomataceae），玉蕈属（Hypsizigus），菇体洁白清亮，质地紧密脆嫩，口感滑腻鲜美，是一种深受全世界消费者喜爱的上乘山珍，享有食用菌中的“金枝玉叶”的美称[1]。麦角固醇（又称麦角甾醇）是白玉菇中重要的生物活性物质，其化学名称为24β-甲基胆固醇-5,7烯-3β-羟基（图1A），具有与膜结合酶的活性，对确保膜结构的完整性、流动性、细胞活力、物质运输等方面起着重要作用，还是一种重要的化工原料，可用于“可的松”、“黄体酮”等药物的生产[2]。

研究[3-5]发现麦角固醇对肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用，可作为有效的抗癌物质。此外，麦角固醇还是VD2的前体化合物，在受到紫外光照射时，分子中一个碳环发生断裂，转化为VD2[6-8]。VD2又称麦角钙化甾醇，化学名称为9,10-开环麦角甾-5,7,10(19),22-四烯-3β-醇，化学结构式如图1B所示，是麦角固醇的同分异构体，能调控钙、磷代谢和骨稳态，促进孕妇和老年人对钙磷的吸收[9-11]，影响细胞的增殖分化[12-13]，对调节生命代谢功能有重要作用。

图1 麦角固醇（A）和VD2（B）结构式Fig. 1 Chemical structures of ergosterol (A) and VD2 (B)

麦角固醇的检测方法主要有紫外分光光度法法[14-16]、薄层色谱扫描法[17-18]、高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[19-21]法和气相色谱法[22-23]等，VD2常采用HPLC法[24-26]。文献报道的方法均为麦角固醇或VD2单一组分的测定，如研究者[27-29]分别用HPLC和气相色谱法分析栽培蘑菇中VD2和麦角固醇的含量，发现栽培蘑菇中都含有丰富的麦角固醇，却几乎没有VD2。麦角固醇和VD2之间特殊的光转化关系导致食用菌中两者的含量存在动态变化，建立同步定量检测麦角固醇和VD2的分析方法对白玉菇中有效成分的质量控制及食用菌相关新产品的研发具有重要的意义。基于HPLC-MS/MS高效分离能力、高分辨率和高灵敏度技术优势[30-31]，本研究通过两种方法中检测条件的优化与方法学评价，旨在建立HPLC-MS/MS法快速准确同步检测白玉菇中麦角固醇与VD2的检测方法，为食用菌新产品研发与质量标准完善提供理论依据与技术方法，对于开展同分异构体的同步检测具有重要现实意义与理论价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜白玉菇（市售），经干燥、研磨成粉末状后备用；麦角固醇、VD2标准品（纯度＞98%） 美国Sigma公司；氢氧化钠、无水乙醇、石油醚（均为分析纯）广州化学试剂厂；甲醇（色谱纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；超纯水（18.2 MΩ/cm） 美国Thermo Scientific公司。

1.2 仪器与设备

ABI4000 Q TRAP型HPLC-MS/MS联用仪 美国应用生物系统公司；1100 HPLC仪（配二极管阵列检测器及数据分析平台） 美国Agilent公司；超纯水仪 美国Thermo Scientific公司；烘箱 上海福玛实验设备有限公司；旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（III）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；CP224C电子天平 奥豪斯仪器有限公司；电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 两种方法检测条件

HPLC-MS/MS联用法：电喷雾离子源正离子检测方式下采用多反应选择离子监测（multi-reaction monitoring，MRM）模式进行二级质谱分析。色谱柱：Agilent SB-C8Rapid Res长柱（2.1 mm×100 mm，3.5 µm）和Agilent SB-C8Rapid Res短柱（2.1 mm×50 mm，3.5 µm）；流速：500 µL/min（50 mm C8）、250 µL/min（100 mm C8）；流动相：100%甲醇；柱温：22 ℃；进样量：5 µL/min；离子源参数：雾化气压力310.3 kPa，辅助气压力413.7 kPa；气帘气压力137.9 kPa；离子源温度500 ℃，离子源喷雾流速5 L/min。

HPLC法：COSMOSIL Column 5C18-MS-II（4.6 mm×250 mm，5 µm）；柱温30 ℃；流动相100%甲醇；流速1 mL/min；检测波长270 nm；进样量10 µL；运行时间15 min。

1.3.2 标准曲线的绘制

精密称取麦角固醇标准品30.00 mg，VD2标准品10.00 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加入无水乙醇溶解并定容、摇匀，即得麦角固醇质量浓度为3 mg/mL、VD2质量浓度为1 mg/mL的标准品储备母液。将母液用无水乙醇依次稀释配制成HPLC-MS/MS联用法和HPLC法所需质量浓度的混合标准溶液。以麦角固醇及VD2标准品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 供试品溶液的制备

取市售鲜白玉菇子实体适量，烘干，研碎，取1 g干粉置于磨口烧瓶，加40 g/L的NaOH溶液25 mL，再加入50 mL无水乙醇，在85 ℃水浴中皂化回流90 min。皂化完毕，滤纸过滤皂化液，冷却至室温，加25 mL石油醚，充分振荡15 min，静置分层。上层无色萃取液用旋转蒸发仪45 ℃时蒸去石油醚，蒸干后样品用无水乙醇定容到10 mL容量瓶，供试品溶液测定前用0.45 μm微孔滤膜过滤。

1.3.4 样品中麦角固醇、VD2含量的计算

式中：C1、C2分别为麦角固醇、VD2质量浓度；V1、V2分别为麦角固醇、VD2的定容体积；N1、N2分别为麦角固醇、VD2的稀释倍数；W1、W2分别为麦角固醇、VD2萃取时样品的干质量。

1.4 统计分析

采用SPSS 19软件进行数据统计分析，采用Excel软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 HPLC-MS/MS联用法检测条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

不同色谱柱柱长可能会影响混合物组分的分离效果和分离时间[32]，研究Agilent SB-C8Rapid Res长柱（2.1 mm×100 mm，3.5 µm）和Agilent SB-C8Rapid Res短柱（2.1 mm×50 mm，3.5 µm）对白玉菇样品中麦角固醇和VD2的分离情况，结果如图2、3所示。比较样品MRM色谱图发现，C8短柱与C8长柱均能获得良好的分离度和色谱峰形，色谱峰窄且尖锐，C8短柱的响应信号较C8长柱稍弱，但与长柱相比，仅需4.5 min左右即可实现对两种组分的快速分离，基于此，后续实验选用50 mm C8柱进行同步检测。

图2 100 mm C8柱中麦角固醇（A）和VD2（B）的分离MRM色谱图Fig. 2 MRM chromatograms of ergosterol (A) and VD2 (B) on 100 mm long C8 column

图3 50 mm C8柱中麦角固醇（A）和VD2（B）的分离MRM色谱图Fig. 3 MRM chromatograms of ergosterol (A) and VD2 (B) on 50 mm long C8 column

2.1.2 质谱分析参数优化

采用电喷雾离子源正离子模式对麦角固醇和VD2标准品进行全波扫描，确定麦角固醇和VD2母离子参数，调整气帘气电压、雾化气流速、辅助气压力、离子源温度等参数，降低噪音，提高母离子稳定性和响应信号，优化锥孔电压、碰撞电压、摄入电压及碰撞室射出电压等参数（表1），MRM模式下进行质谱分析。

表1 麦角固醇及VD2的质谱分析参数Table 1 Mass spectrometric parameters of ergosterol and VD2

在一级质谱图中从特征母离子中选择适宜的子离子，根据MRM模式下进行二级质谱分析，使母离子的响应信号降低，子离子的响应信号增强，结果如图4、5所示。

图4 麦角固醇的一级（A）、二级（B）质谱子离子扫描图Fig. 4 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of ergosterol

图5 VD2的一级（A）、二级（B）质谱子离子扫描图Fig. 5 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of VD2

2.1.3 定量离子对的选择

图6 不同离子对VD2和麦角固醇的分离MRM色谱图Fig. 6 MRM chromatograms of VD2 and ergosterol with different ion pairs

麦角固醇与VD分子结构中多为烷烃和烯烃的组合（图1），轰击产生的离子碎片较多，且难发现明显的特征离子对。麦角固醇与VD2在MS1＋扫描中主要生成[M＋H－H2O]＋准分子离子峰m/z 379.3（图4A）与397.3（图5A），对两者进行MS2＋扫描，生成信号较高的主要碎片离子，如麦角固醇二级特征离子m/z为125.3、253.3（图4B）、VD2的二级特征离子m/z 125.3、271.3（图5B）。实验表明，如果选用m/z 69.2、107.2等低质量端的离子容易产生干扰，通常选择丰度较高且干扰小的离子作为特征离子，两种物质二级质谱图中含有相同的特征离子m/z 125.3，推测为同一烯烃碎片离子C9H17＋，可作为同步检测麦角固醇与VD2定性定量依据。

从图6可知，选用不同离子对计算出来的麦角固醇与VD2含量并无显著差异，选用m/z 397.3/271.3离子对定量VD2时MRM色谱图的杂峰比选用m/z 397.3/125.3多，导致基线极不平稳，选择m/z 397.3/125.3作为VD2定量离子对，m/z 379.3/125.3作为麦角固醇定量离子对，通过组内、组间方差分析，研究结果并无显著差异（表2、3）。

表2 离子对的选择对VD2和麦角固醇测定结果的影响Table 2 Effect of different ion pairs on VD2and ergosterol contents

表3 方差分析结果Table 3 Results of analysis of variance

2.2 HPLC法检测条件的优化

2.2.1 流动相流速选择

柱效是柱中流动相线性流速的函数，不同的流速可得到不同的柱效。对于特定的色谱柱，要获得最佳柱效需采用最佳流速。流动相流速研究结果如表4、5所示。

表4 麦角固醇/VD2混合标准品在不同流动相配比下的保留时间、响应信号和峰面积Table 4 Retention time, response signal and peak area of ergosterol/VD2mixed standard solution at different mobile phase compositions

由表4可知，随着甲醇比例的增加，保留时间随之缩短，信号响应值随之增加，峰面积基本接近，选用100%甲醇作为流动相，保留时间短，响应信号值高，分离效果较好。

表5 麦角固醇/VD2混合标准品在不同流速下的保留时间、响应信号和峰面积Table 5 Retention time, response signal and peak area of the ergosterol/VD2mixed standard solution at different flow rates

由表5可知，流速为0.8 mL/min时，保留时间较长；流速为1.2 mL/min时，标准品的峰面积相对较低，流动相流速选取为1 mL/min时，标准品的保留时间和峰面积适中。

2.2.2 柱温的选择

表6 麦角固醇/VD2混合标准品在不同柱温下的保留时间、响应信号和峰面积Table 6 Retention time, response signal and peak area of the ergosterol/VD2mixed standard solution at different column temperatures

从表6可知，随着柱温的升高，麦角固醇和VD2的保留时间与响应信号略有变化，柱温选择30 ℃时麦角固醇和VD2的峰面积较高。

HPLC条件优化为波长270 nm、100%甲醇、柱温30 ℃、流速1 mL/min、进样量10 μL时，麦角固醇和VD2单标与混标保留时间都如图7所示，色图谱基线平稳，峰形尖锐对称，主峰与其他色谱峰实现较好分离，所有样品在15 min内检测完毕。

图7 麦角固醇、VD2单标（A）和混合标准溶液（B）HPLC谱图Fig. 7 HPLC chromatograms of VD2, ergosterol standards (A) and mixed standard (B)

2.3 两种同步检测方法学的评价

2.3.1 线性方程、检出限与定量限

一定范围浓度的麦角固醇和VD2标准溶液采用优化检测条件下建立的HPLC-MS/MS联用法及HPLC法进行测定，并进行线性回归，按3 倍信噪比和10 倍信噪比计算方法分别确定检出限和定量限，参数与结果见表7。

表7 HPLC-MS/MS及HPLC方法的线性回归参数Table 7 Overview of the linearity data obtained by HPLC-MS/MS and HPLC

如表7所示，HPLC-MS/MS联用法中，在质量浓度0.15～6 mg/L与0.01～1 mg/L范围内，标准品麦角固醇与VD2浓度均与峰面积呈现良好的线性关系；HPLC法中，标准品麦角固醇质量浓度在15～750 mg/L与VD2质量浓度在0.5～50 mg/L范围内，均与峰面积呈现良好的线性关系。与HPLC法相比，HPLC-MS/MS联用法检出限、定量限与检测时间均低于HPLC法。

2.3.2 重复性评价

同一混标样品取3 份精密称定1 g，制备样品溶液。用两种检测方法分别测定VD2和麦角固醇含量，记录峰面积积分值，按照各自的标准方程计算含量及其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值，结果如表8所示，数据表明两种检测方法具有良好的重复性，但对于低浓度的VD2检测，HPLC法缺乏有效性。

表8 HPLC-MS/MS及HPLC方法的重复性实验结果Table 8 Results of repeatability obtained by HPLC-MS/MS and HPLC

2.3.3 加标回收率与仪器精密度

分别精确称定1 g已知VD2和麦角固醇含量的样品3 份准确加入一定量的VD2和麦角固醇标准品，按照样品处理方法制备样品溶液。用两种检测方法分别测定VD2和麦角固醇含量，按外标法以峰面积计算含量，结果如表9所示。两种检测方法RSD低于均低于6%。

表9 HPLC-MS/MS的VD2回收率实验结果（n=3）Table 9 Recovery of VD2by HPLC-MS/MS (n= 3)

2.3.4 日内和日间精密度实验结果

配制高中低麦角固醇和VD2标准品溶液，每天进样3 次连续测定3 d，记录麦角固醇和VD2的峰面积积分值，计算各自峰面积的RSD计算日间和日内差异，结果如表10所示。

表10 HPLC-MS/MS及HPLC方法的日内和日间精密度实验结果Table 10 Results of intra-day and inter-day precision obtained by HPLC-MS/MS and HPLC

由表10可见，较高质量浓度范围内，HPLC法日内和日间精密度较高，RSD均低于1%，低质量浓度的检测HPLC-MS/MS联用法更具优势，低、中、高3 个水平的麦角固醇和VD2标准品日内和日间精密度实验结果的RSD均低于7%，表明两种方法精密度良好。

2.4 样品检测与系统适应性

图8 白玉菇样品中VD2和麦角固醇HPLC色谱图Fig. 8 Chromatograms of VD2 and ergosterol in white H. marmoreus sample

从图8可知，麦角固醇与VD2分别在12.701 min与9.828 min出峰，峰后有少量杂峰但不影响麦角固醇与VD2的定性与定量分析。

白玉菇样品中麦角固醇和VD2MRM色谱图如图9所示，供试品溶液中虽有微量的杂质峰干扰，但对样品测定无影响，建立的两种检测方法专属特异性强系统适应性好。

图9 白玉菇样品中麦角固醇（A）和VD2（B）MRM色谱图Fig. 9 MRM chromatogram of ergosterol (A) and VD2 (B) in white H. marmoreus sample

市售3 种不同厂家的白玉菇样品采用上述两种方法测定，白玉菇中麦角固醇和VD2的含量结果见表11。

表11 不同厂家市售白玉菇中麦角固醇和VD2两种检测方法测定结果比较（n=3）Table 11 Comparison of results obtained for determination of ergosterol and VD2by HPLC-MS/MS and HPLC in commercially available white H. marmoreus from different manufacturers (n= 3)

市售白玉菇样品检测结果（表11）可知：HPLC-MS/MS法可以有效检测麦角固醇与微量的VD2；HPLC法仅能测定麦角固醇含量，含量高于HPLC-MS/MS法，且无法检测出白玉菇样品中微量的VD2含量，两种方法的检测结果存在一定的差异性，从测定原理看，HPLC-MS/MS是采用HPLC系统将物质分开后，经质谱检测系统，使各组分电离成不同m/z的离子，通过分析离子化样品的m/z实现对被测化合物定性定量分析；HPLC是一种以液体为流动相的色谱系统，待测样品随流动相进入装有固定相的色谱柱，在柱内利用液-液分配或吸附作用实现待测组分的分离进入二极管阵列检测器检测，以标准物质的HPLC色谱和保留时间定性，峰面积定量。研究结果与测定效率表明，HPLC-MS/MS高分辨率与高灵敏度和定性定量能力，与HPLC法相比，具有更低的检出限，更短的检测时间。

3 结 论

本实验建立HPLC-MS/MS与HPLC两种同步检测白玉菇样品中麦角固醇和VD2含量方法与方法学评价，通过对市售白玉菇样品中麦角固醇和VD2含量进行检测与系统适应性分析，对比两种方法检测的差异性。HPLC-MS/MS方法则具有更高分离和定性定量的能力，在检测过程中可以锁定目标离子，排除存在杂质的离子干扰，灵敏度和准确度更高。两种方法都可用于麦角固醇和VD2的同步定量测定，在相应的线性浓度范围内，与HPLC法相比，HPLC-MS/MS法检测麦角固醇和VD2的线性范围、检出限和定量限更低，分析时间更短灵敏更高，适用于痕量物质的测定和同分异构体样品分析，为食用菌新产品研发与质量标准完善提供理论依据与技术方法具有重要现实意义。