基于GC-MS技术对不同产地稻米的代谢组学分析

富天昕，冯玉超，张丽媛,2，李 雪，王长远,2,*

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室，黑龙江 大庆 163319）

代谢组学这一概念由Nicholson在2002年提出，是继基因组学和蛋白质组学之后新发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分[1]。概念提出后，该领域的研究迅速发展并渗透到多个领域[2-3]。植物代谢组学是代谢组学的重要分支，它主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物（mw＜1 000 Da），结合基因、蛋白质、表型等综合分析植物的生理生化过程[4-5]。而植物体的最终表现方式则由代谢产物体现，代谢产物在生物体信息传递链的末端，是植物代谢的最终产物[6]。

近年来植物代谢得到迅速发展，而稻米作为主要粮食作物之一，也成为研究的热点[7-11]。稻米中富含丰富的蛋白质、糖类、脂肪和膳食纤维等营养成分且氨基酸组成比较完全，有助于人体的吸收[12]。稻米的品质不仅与品种有关，还与其生长环境密切相关。不同产地的稻米因其种植的土壤、气候、水源不同，其营养品质和代谢产物的种类、含量也不尽相同[13]。代谢组学的研究方法，可以从系统生物学的角度解释代谢物变化与生命活动现象的关系，近几年代谢组学在农产品鉴别与产地区分方向应用广泛，为农产品的溯源提供了新的途径[14-18]。气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术具有重复性好、灵敏度高等特点，是目前代谢组学研究中广泛运用的分析技术并且有很长的研究历史[18-22]。田福林等[23]利用GC-MS技术对4 种不同产地大米中的脂溶性成分进行分析，结合主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析，建立一种对不同产地大米进行快速鉴定的方法。本实验利用GC-MS联用技术对黑龙江省建三江地区和响水地区的稻米进行差异代谢物的研究，探讨产地对水稻代谢物的影响，并从代谢物的角度着手，筛选对区分2 个产地具有重要作用的差异代谢物，为通过代谢物对稻米进行产地溯源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水稻采自黑龙江省建三江和响水地理标志稻米保护区，建三江采样地点选择为12 个农场布点；响水采样地点选择5 个乡镇布点，均选择主产县、主产乡（镇或管理区）、主产村（屯）的大面积种植地块进行采样，采样点依照种植范围大小设置，每块地块随机设置分点5 个重复，采样地点按照东、西、南、北、中5 个区域设计，依据代表性采样原则，每个采样点按照不同方位采集1～2 kg稻穗，每个产区选取30 个样本。响水地区水稻品种为稻花香，建三江地区品种主要为龙粳系列，龙粳26、龙粳29、龙粳31、龙粳39、龙粳40、龙粳43、龙粳46，以及绥粳4、松粳9等。

吡啶（纯度≥99.9%）、甲醇（均为色谱纯） 美国阿拉丁试剂有限公司；2-氯苯丙氨酸（纯度98.5%）、甲氧基胺盐酸盐（纯度98%）、99% N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺（含1%三甲基氯硅烷） 上海麦克林试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A/5975C GC-MS联用仪、HP-5ms色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；QP2010 GC-MS联用仪 日本岛津公司；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；MTN-2800D氮吹浓缩装置 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；恒温箱 上海森信实验仪器有限公司；TGL-16B台式离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

样品制备根据王玲[24]的方法加以改进。稻种子液氮研磨后称取50 mg粉末于2 mL的EP管中，加入800 μL甲醇和10 μL内标（2-氯苯丙氨酸），涡旋混匀30 s，置于4 ℃离心机中，12 000 r/min离心15 min，吸取200 μL上清液，转入进样小瓶中氮气吹干。衍生化：取30 μL甲氧氨盐酸吡啶溶液至浓缩后的样品中，涡旋混匀至完全溶解，置于37 ℃恒温箱90 min，取出后加入30 μL N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺，置于70 ℃烘箱60 min，取出后待检测。

1.4 数据处理

数据的特征峰提取和预处理在R软件平台采用XCMS软件包条件下进行，将处理的数据矩阵导入SIMCA-P软件，进行PCA[24]、正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等多元统计分析，再根据变量对分组贡献值（variable importance in the projection，VIP）的大小和组间变化的显著性（P＜0.05）进行差异性代谢产物的筛选。差异性代谢物的定性方法为：根据保留时间及质荷比（m/z）在NIST商业数据库和Wiley Registry代谢组数据库进行注释。

2 结果与分析

2.1 GC-MS分析

2.1.1 典型离子流色谱分析

由图1可以看出，色谱峰基线平稳，峰分离效果良好，仪器稳定性良好。

图1 典型样本的总离子流色谱图Fig. 1 Typical total ion chromatogram of rice metabolites

2.1.2 代谢组分的质谱分析

通过对GC-MS原始数据的处理，两产地60 个稻米种子样品中共扫描到143 个峰，根据保留时间及m/z在NIST商业数据库和Wiley Registry代谢组数据库进行注释，共注释到39 个代谢产物，其中建三江地区有29 个代谢产物，响水地区有26 个代谢产物，如表1所示。

表1中1～16号为建三江地区和响水地区共同存在的代谢物，17～29号为建三江地区稻米样品相对于响水地区样品具有的代谢物，30～39号为响水地区稻米样品相对于建三江地区样品具有的代谢物，除共同存在的代谢物外，2 个产地单独具有的代谢物并不一定是相应产地特有的代谢物，可能还与稻米样品的品种有关，由此可知，产地不同，稻米的代谢物的数量不也相同。如表2所示，建三江地区与响水地区相比，多元醇、有机酸类物质含量要高于响水地区，而响水地区的糖类、脂肪酸、氨基酸和其他类物质要高于建三江地区，核苷酸类物质含量相差不多，可见产地不同对稻米代谢物的种类也会有影响。

表2 建三江地区和响水地区稻米代谢物分类Table 2 Classification of metabolites in rice samples from Jiansanjiang and Xiangshui%

2.2 两产地稻米的代谢组学差异分析

2.2.1 PCA结果

图2 2 种样品的PCA得分图Fig. 2 PCA scores plot of two rice samples

为判别建三江地区和响水地区稻米样品间的差异，首先采用PCA方法进行分析，共得到3 个主成分，累计R2X=0.675，Q2=0.52，2 个参数数值均大于0.5，且二者数值相差不大，说明PCA效果较好。如图2所示，两产地稻米样品除个别异常样品外绝大部分的样品均处于在置信区间内，但两产地样品并未完全分开，还存在个别的重叠样品，说明这些样本中所含有的分子的组成和浓度越接近，而分子组成和浓度接近可能是相同品种间的聚集，也有可能是不同品种但是组分含量上相近。PCA这种无监督分析方法不能忽略组内误差、消除与研究目的无关的随机误差，所以不利于发现组间差异，之后将采用有监督的方法进行进一步研究。

2.2.2 OPLS-DA结果

通过OPLS-DA可以过滤掉代谢物中，与分类变量不相关的正交变量，并对非正交变量和正交变量分别分析，从而获取更加可靠的代谢物的组间差异与实验组的相关程度信息[26]。如图3所示，建三江地区的稻米样品主要分布在置信区间的左侧，响水地区的稻米样品主要分布在置信区间的右侧，两产地稻米样品区分效果很好。本次OPLS-DA得到2 个主成分，R2X=0.575，R2Y=0.63，Q2=0.479，3 个参数数值接近或大于0.5，且相差不多，说明OPLS-DA模型可解释度较好，相比于PCA模型效果更好。

图3 两产地样本OPLS-DA得分图Fig. 3 OPLS-DA score plot of two rice samples

2.2.3 OPLS-DA置换检验结果

置换检验通过随机改变分类变量Y的排列顺序，多次建立对应的OPLS-DA模型以获取随机模型的R2和Q2值，在避免检验模型的过拟合以及评估模型的统计显著性上有重要作用。对OPLS-DA模型的置换检验结果如4图所示。

图4 建三江地区与响水地区稻米样品OPLS-DA置换检验结果图Fig. 4 OPLS-DA replacement test results of rice samples collected from Jiansanjiang and Xiangshui

由图4可知，所有R2点从左到右均低于最右的原始的R2点，所有Q2点均低于右侧的原始Q2点，且点的回归线与横坐标交叉或者小于0，说明OPLS-DA模型是可靠的，可以较好地解释两组样本之间的差异。同时随着置换保留度逐渐降低，置换的Y变量比例增大，随机模型的R2和Q2均逐渐下降，说明原模型不存在过拟合现象，模型稳健性较好。

2.2.4 两地区稻米样品的差异代谢物鉴定

采用OPLS-DA模型的VIP值（阈值＞1），并结合学生氏t检验（t-test）的P值（阈值＜0.05）来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：根据保留时间及m/z在NIST库和Wiley Registry代谢组数据库中查找与其匹配的物质。两地区样品差异代谢物的定性结果见表3。由表3可知，两产地水稻样品共筛选出16 种差异代谢产物，由log2（fc-XS/JSJ）值可知，筛选出的16 种差异代谢物中除α-D-甲基呋喃果糖苷外，其余15 种差异代谢物含量均是响水地区稻米样品高于建三江地区的稻米样品，且倍数在1.54～3.05之间，含量差异显著，虽然α-D-甲基呋喃果糖苷的含量是建三江地区高于响水地区，但是可以看出高出的倍数为0.02，数值很小。整体看来响水地区稻米中差异代谢物的含量要高于建三江地区，说明稻米的产地不同，相同代谢产物的含量也有明显差异，稻米代谢产物受产地的影响显著。

表3 两地区样品差异代谢物的定性结果Table 3 Qualitative analysis of differential metabolites in rice samples collected from two regions

2.3 差异性代谢产物分析

2.3.1 差异代谢物热图分析

图5 差异代谢物热图Fig. 5 Heatmap of the differential metabolites

通过R（v3.3.2）中pheatmap程序包对数据集进行数据缩放，同时对样本和代谢物进行双向聚类。由图5可知，图中红色区域表示差异代谢物的高表达区，绿色部分表示差异代谢产物的低表达区。通过筛选出的差异代谢物将两产地的样品进行聚类分析，响水地区的稻米样品主要集中在红色的高表达区域，而建三江地区的稻米样品则主要集中在绿色低表达区，说明响水地区的稻米样品中差异代谢物的含量普遍高于建三江地区，响水稻米样品中的差异代谢物的代谢机能更为活跃，同时也可以看出同产地样品的代谢物具有相近的表达程度，可见产地对稻米的代谢具有很大的影响。影响水稻生长的因素非常复杂，其中温度与光照是最为重要的因素[27]。响水地区所处的地理位置位于火山爆发出的岩浆凝结的熔岩台地，地温、水温比一般的稻田地高2～3 ℃左右，在昼夜温差大的北方，形成了有利的稻米生长环境，使其具备更好的温度和湿度条件，较高的温度条件能增强水稻的光合作用和根叶的呼吸作用，从而提高了稻米的代谢速率[28]，这可能是导致响水地区的稻米代谢产物高表达的原因。

2.3.2 差异代谢物通路分析

京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG）注释分析仅找到所有差异代谢物参与的通路，MetPA数据库通过代谢通路浓缩和拓扑分析，能识别出可能的受生物扰动的代谢通路，可以对通路进行进一步的筛选，找到与代谢物差异相关性最高的关键通路，结果如表4所示。

表4 差异代谢物参与的代谢途径明细Table 4 List of metabolic pathways with the involvement of differential metabolites

富集分析和拓扑分析共标注到4 个较为重要的代谢途径，包括脂肪酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、嘧啶代谢、氨酰-tRNA生物合成。脂肪酸可为稻米提供能量，且对植物本身的抗逆性起重要的作用，使其可以适应寒冷的生长环境[29]。精氨酸和脯氨酸是稻米氨基酸重要组成，脯氨酸是稻米代谢产物中重要的渗透调节物质，它起到保持原生质和环境渗透平衡、阻止水分丧失的作用。此外，脯氨酸还直接影响蛋白质的稳定性，还可作为含氮的储藏物质和恢复生长的能源，还有研究表明，低温下水稻幼苗脯氨酸含量会随着胁迫时间的延长而增加[30-31]。不同产地环境特点不同，尽管建三江地区与响水地区位于同省份内，且均适合水稻的生长，但建三江地处三江平原腹地，属寒温带湿润季风气候，年平均气温1～2 ℃，平均降水量为550～600 mm，而响水大米产区宁安市属温带大陆性季风气候，年平均气温3.5 ℃，平均降水量为400～600 mm，气温、降水量均有较大差异，所以其产地生长的稻米为适应环境会通过调节代谢水平来适应环境，以便更好地生长，从而其各种代谢物的含量会出现差异，同时也会赋予稻米不同的品质。氨酰-tRNA生物合成是形成蛋白质的重要通路。在蛋白质的生物合成中，氨酰-tRNA作为氨基酸转移到肽链的羧末端过程的中间物而发挥重要的作用[32-33]。氨酰-tRNA合成酶在识别它所催化的氨基酸时需要ATP，所以光照是氨酰-tRNA生物合成途径的关键因素[34]，响水大米的光照周期明期与暗期比为7∶17，建三江大米的光照周期明期与暗期比为6∶18，两地区均有充足的光照可满足氨酰-tRNA生物合成途径，但光照情况还是有所差异。产地的差异对水稻机体的多种终端代谢途径造成了一定影响，但产地影响稻米代谢途径及其机理尚未清楚，有待进一步研究。

3 结 论

本研究基于GC-MS的代谢组学技术对黑龙江省响水地区和建三江地区的60 个的稻米样品进行代谢组学分析，考察不同产地对稻米代谢产物的影响。实验共鉴定出39 个代谢产物，其中响水地区包括26 个代谢产物，建三江地区包括29 个代谢产物。对样品进行PCA和OPLSDA等多元分析，两产地共筛选出16 种差异代谢物，响水地区稻米差异代谢物含量要高于建三江地区，且倍数在1.54～3.05 倍之间，通过差异代谢物可以对两产地的稻米样品进行较好的区分，说明不同产地生长的稻米其代谢产物的种类和含量均不相同，产地对稻米的代谢具有重要的影响，而稻米的代谢产物可能携带着其产地的信息。综上所述，基于GC-MS技术的代谢组学分析方法用于分析产地对水稻代谢产物的影响具有一定的可行性，可为因环境不同而导致的稻米品质差别提供可视化的理论基础。实验证明利用基于GC-MS联用技术，结合多元统计分析的方法，可用于分析环境对水稻代谢产物的影响，可为稻米的溯源提供理论基础。