混菌发酵苹果浊汁的益生菌筛选及其发酵动力学模型构建

2019-07-05孟掉琴岳田利高振鹏

食品科学 2019年12期

孟掉琴，吴霞，岳田利，高振鹏*

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，国家杨凌农业综合实验工程技术研究中心，农业部农产品质量安全风险评估实验室（杨凌），陕西杨凌 712100）

益生菌是指被人体或动物摄入一定数量后，能促进宿主健康的活性微生物[1]，具有调节肠道菌群、降低胆固醇、增强免疫力、缓解口腔疾病及情绪异常等作用[2-4]。目前市场上益生菌发酵产品主要为益生菌发酵乳制品，但由于益生菌发酵乳制品具有乳糖不耐受与高胆固醇两大不足[5]，开发新的非乳益生菌发酵产品是目前的研究热点，同时也符合消费者追求食品绿色天然健康的理念。

研究表明果蔬汁是益生菌发酵的良好载体，目前已有对刺梨汁、石榴汁、苹果清汁及胡萝卜汁等果蔬汁进行益生菌发酵的研究报道[6-8]。目前国内外研究主要集中于对发酵果蔬汁发酵过程中和货架期期间理化指标的变化，且发酵菌种多为单菌或双菌发酵，3 株以上的混合菌株发酵研究较少。其中Dimitrovsk等[9]用植物乳杆菌PSC26发酵苹果清汁，与对照组相比，发酵过程中添加5%乳清，活菌数明显增加；Pereira等[10]以干酪乳杆菌发酵腰果苹果汁，发酵后对贮存稳定性及色值变化等指标进行研究；李维妮等[11]以乳酸菌单一菌种和多菌组合分别发酵苹果清汁，测定发酵后香气成分并进行感官评定，研究表明多菌发酵香气成分含量及感官评分均高于单菌发酵。混菌发酵过程中单菌株既可发挥自身作用，又可通过菌株间协同作用发挥更大价值，生成多种代谢产物，产生多种香气成分[12]。

由于益生菌发酵苹果浊汁容易发生褐变、沉淀，因此，相关研究鲜见报道。此外，与苹果清汁相比，苹果浊汁膳食纤维的含量明显增加，浊汁的悬浮果肉颗粒包含果胶、蛋白质、脂肪、半纤维素和纤维素等成分，拥有更柔和的口感、饱满的风味、丰富的营养价值[13]。对苹果浊汁进行益生菌发酵，既保留了苹果浊汁自身营养成分，又包含活的益生菌及发酵所产生的独特风味与功效，同时使益生菌产品多元化，消费者也有了更多选择。

目前有关益生菌发酵动力学的研究主要以发酵酸奶为主，益生菌发酵果蔬汁动力学研究甚少。本研究对复合益生菌发酵苹果浊汁进行菌种筛选，得到较适苹果浊汁发酵的复合菌种，并对复合菌株发酵苹果浊汁的菌体生长、产物生成和底物消耗动力学模型进行构建及研究，描述发酵过程动态变化，有效地控制发酵过程，旨在为推动复合益生菌发酵苹果浊汁的产业化提供一定的技术支持和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长富苹果陕西杨凌市场；MRS肉汤培养基北京奥博星生物技术有限责任公司。

乳酸菌菌种：副干酪乳杆菌20241（Lactobacillus paracasei）、动物双歧杆菌 6165（Bifidobacterium animalis）、嗜热链球菌6063（Streptococus thermophilus）、嗜酸乳杆菌 6005（Lactobacillus acidophilus）、鼠李糖乳杆菌50513（Lactobacillus rhamnosus）、短乳杆菌367（Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌21805（Lactobacillus plants）、肠膜明串珠菌22184（Leuconostoc mesenteroides）、发酵乳杆菌 21828（Lactobacillus fermentum）、干酪乳杆菌393（Lactobacillus casei），均保存于西北农林科技大学食品科学与工程学院健康食品制造与安全控制实验室。

1.2 仪器与设备

2000JP-1型离心果汁机南通金橙机械有限公司；YXQ-LS-70A型立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HWS-80型智能恒温恒温箱宁波海曙赛福实验仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 苹果浊汁制备流程

苹果→清洗→破碎→榨汁（80 目过滤）→护色（0.08%抗坏血酸[14]）→灭酶（90 ℃、15 s[15]）→巴氏杀菌（80 ℃、15 min）

1.3.2 苹果浊汁发酵

将保存于甘油管的菌株分别置于MRS液体培养基中活化2 代，按1%接种量接种于100 mL苹果浊汁种子液中，37 ℃静置发酵18 h，活菌数约达1×107CFU/mL，之后将种子液按3%接种量接种于300 mL苹果浊汁中，37 ℃静置发酵24 h，期间定时取样测定pH值、滴定酸度及活菌数。

1.3.3 指标测定

总酸的测定：GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[16]直接滴定法；总糖含量的测定：SB/T 10203—1994《果汁通用试验方法》[17]斐林试剂滴定法；活菌数测定：倾注平板法[18]。

感官评定：9 点快感标度法[19]；对酸甜度、口感、色泽、香气、整体接受性进行打分，由20 位受过感官训练的老师和同学组成评定小组，对发酵苹果浊汁进行感官评价，每项性质都有9 种不同的等级，以表示评定人员对它的喜好程度，1：极度不喜欢；2：极不喜欢；3：中等不喜欢；4：轻度不喜欢；5：无所谓；6：轻度喜欢；7：中等喜欢；8：很喜欢；9：极度喜欢。

1.3.4 益生菌耐酸、耐胆盐筛选

将10 株菌株从甘油管中接种至MRS液体培养基中，活化2 代。对原菌液的活菌进行计数，同时取1 mL原菌液分别加入到5 mL预先用盐酸将pH值调至2.5的MRS液体培养基及胆盐质量分数为0.3%的MRS液体培养基中，置于37 ℃培养箱培养3 h，3 h后对菌液进行计数，比较其耐酸、耐胆盐能力[19-20]。

1.3.5 益生菌产酸能力筛选

将获得的耐酸、耐胆盐菌株以3%的接种量分别接到苹果浊汁中，37 ℃静置培养28 h，每隔4 h取样，分别测定发酵苹果浊汁中的pH值和滴定酸度，选择产酸能力强、产酸速率快的菌株进行复筛。

1.3.6 复合菌株间拮抗实验

采用双层琼脂扩散法[21]，将10 μL的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌及发酵乳杆菌的培养液分别与10 mL灭菌后的半固体MRS培养基混合均匀后，立即倒入下层琼脂培养皿中，待凝固后放入牛津杯，每个牛津杯中加入100 μL稀释至一定梯度的菌液，37 ℃培养24 h后观察牛津杯周围是否出现抑菌圈，若没有出现抑菌圈说明本底菌与接种菌株无拮抗作用；反之，则说明2 种菌之间存在拮抗作用。

1.3.7 复合菌株比例的确定

将筛选出来的菌株以不同比例按3%接种量于苹果浊汁发酵基质，在37 ℃发酵24 h，发酵结束后进行感官评定，同时测定发酵后活菌数，确定苹果浊汁发酵的较佳菌株比例。

1.3.8 动力学模型的建立

根据筛选得到的较佳复合菌株及比例，建立复合菌株发酵苹果浊汁的菌体生长、产物生成和底物消耗动力学模型，并利用复合菌株发酵苹果浊汁，每隔2 h测定其活菌数、乳酸生成量及总糖消耗量，计算出动力学模型的参数，预测其发酵过程变化。

1.3.8.1 菌体生长动力学模型的建立

应用Logistic方程[22-23]模拟生长变化趋势，建立混合菌株在苹果浊汁发酵过程中动力学模型。生长期细胞的增长速率微分表达式如下：

以t=0、X=Xm为初始条件，将方程（1）积分变形后得方程（2），即：

式中：X0为菌体的初始生物量/（108CFU/mL）；Xm为菌体的最大生物量/（108CFU/mL）；μm为最大比生长速率/h－1；t为时间/h。

将方程（2）积分变形后两边同时取对数得：

1.3.8.2 产物生成动力学模型的建立

产物生成速率与细胞生长速率之间的关系有3 种类型：产物生成与菌体生长偶联型、产物生成与菌体生长部分偶联型及产物生成与菌体生长非偶联型[24-25]。根据Leudeking-piret方程[26]：

式中：P为产物质量浓度/（g/L）；X为生物量/（108CFU/mL）；t为时间/h；α为与菌体生长相关联的产物合成常数；β为与菌体量相关联的产物合成常数。

混菌发酵苹果浊汁产乳酸的过程属于产物生成与菌体生长部分偶联型，即α≠0，β≠0，此时菌体处于稳定期，即：

以t=0时，P=0为初始条件，积分后得：

1.3.8.3 底物消耗动力学模型的建立

在发酵过程中，底物消耗主要有3 个方面：菌体生长、细胞维持生命活动的消耗及生成代谢产物的消耗[27]。从发酵实验结果可知，由于发酵过程生成产物所消耗的底物远远小于发酵过程中菌体的生长和维持细胞代谢所消耗的底物，因此假设底物消耗用于产物生成的一小部分可以忽略，底物消耗主要用于菌体生长和维持细胞代谢活动[28]。因此采用Luedeking方程来描述底物的消耗情况，其方程见下：

式中：S为产物质量浓度/（g/100 mL）；X为生物量/（108CFU/mL）；t为时间/h；γ为底物消耗参数；δ为底物消耗参数。

将式（2）代入式（7），积分后得：

2 结果与分析

2.1 益生菌发酵苹果浊汁菌株的筛选

2.1.1 菌株的耐酸、耐胆盐特性筛选

胃肠道低pH值和高胆汁酸盐是益生菌能否在人体胃肠道内存活并发挥益生作用的关键[29]，因此，筛选出耐酸、耐胆盐的益生菌是益生菌发酵产品的根本。通过耐酸、耐胆盐特性筛选研究，能够较好地反映益生菌在人体胃肠道中的存活的特性。本实验测定了不同菌株在pH 2.5、胆盐质量分数0.3%条件下生长3 h后活菌数变化情况，结果如表1 所示。

表1 菌株耐酸、耐胆盐结果Table 1 Results of tolerance to acid and bile salt in strains

由表1可知，10 株菌株耐酸能力都比较好，只有肠膜明串珠菌22184在pH 2.5条件下3 h后活菌数没有达到106CFU/mL；动物双歧杆菌6165、干酪乳杆菌393、鼠李糖乳杆菌50513在3 h后胆盐耐受性不强，其余菌株都在0.3%胆盐质量分数下存活率都较高，可以发挥其益生作用。植物乳杆菌21805与发酵乳杆菌21828在pH 2.5的情况下存活率超过100%，说明这两株菌在酸性条件下还可以生长，耐酸性比较强。副干酪乳杆菌20241、嗜酸乳杆菌6005、短乳杆菌367在0.3%胆盐质量分数下3 h后存活率均达97%以上，耐胆盐能力较强。经过实验筛选，10 株菌中有6 株菌具有良好的耐酸、耐胆盐特性，它们可以顺利通过人体胃肠道，调节人体肠道菌群平衡，具有很好的益生特性。

2.1.2 菌株的产酸能力筛选

pH值是乳酸菌发酵重要的指标之一，常用来表征乳酸菌的产酸能力，一定程度反映其生长代谢过程[30]。本实验测定了不同菌株随发酵时间各自pH值变化，如图1所示。

图1 不同菌株pH值随发酵时间的变化Fig. 1 Changes in pH of different strains with fermentation time

由图1可知，6 株乳酸菌的产酸能力依次为发酵乳杆菌21828＞嗜酸乳杆菌6005＞副干酪乳杆菌20241＞植物乳杆菌21805＞短乳杆菌367＞动物双歧杆菌6063，6063与367产酸最弱，发酵过程中pH值几乎没有变化。6 株菌中副干酪乳杆菌20241、嗜酸乳杆菌6005、植物乳杆菌21805、发酵乳杆菌21828 pH值均呈下降趋势，在0～4 h pH值变化不明显，此时处于延滞期，菌株生长缓慢，4 h以后进入对数生长期，酸度迅速上升，pH值下降，其中副干酪乳杆菌20241发酵结束后果汁变黏稠，有不良气味，不适合苹果浊汁发酵。因此，确定嗜酸乳杆菌6005、植物乳杆菌21805及发酵乳杆菌21828为较佳的发酵益生菌。

2.1.3 复合菌株间拮抗实验

为防止复配菌株之间存在抑制作用，影响彼此在苹果浊汁发酵基质中的作用，本实验对筛选得到的菌株进行拮抗实验，实验结果如表2所示。

表2 菌株间拮抗性结果Table 2 Results of antagonism between strains

由表2可知，3 株菌之间均未出现明显的拮抗作用，牛津杯周围无抑菌圈出现，与空白组生长情况一样，说明3 株菌可以用于复配发酵，可以在苹果浊汁共同发酵并不会影响各自的生长，因此，这3 株菌可以进行组合发酵苹果浊汁。

2.1.4 发酵苹果浊汁复合菌株比例的确定

益生菌发酵制品最重要的评价指标即口感与活菌数[31]，口感好决定其销售量与受欢迎程度，高活菌数决定其在肠道内的功效。研究表明复合菌株发酵风味、口感均优于单菌发酵[32-33]。本实验将3 株菌以不同比例接种在苹果浊汁中进行发酵，对其感官评分及活菌数进行评价，结果如表3所示。

表3 不同菌株比例发酵苹果浊汁感官评分及活菌数Table 3 Sensory evaluation of fermented samples with different strain ratios

由表3可知，发酵结束后色泽、香气、组织状态不同比例之间差异不显著（P＞0.05），色泽和组织状态的评分都在7～8 分，说明发酵苹果浊汁的色泽和组织状态很受喜欢；酸甜度、口感、整体接受性差异较显著（P＜0.05），其中1∶1∶1口感及酸甜度得分最高，整体接受性最好，是所有比例中得分情况最优的。其他比例发酵后口感偏酸，评分较低，整体接受性较差。发酵结束后活菌数均可达108CFU/mL，其中1∶1∶1发酵后活菌数最高，可达8.5×108CFU/mL，与其他比例复配活菌数相比，差异显著（P＜0.05）。综合感官评价与活菌数结果，最终确定混合菌株发酵复配比例为1∶1∶1。

2.2 动力学参数求解分析

2.2.1 发酵苹果浊汁动力学曲线

为对复合菌株发酵苹果浊汁的菌体生长、产物生成和底物消耗动力学模型参数进行计算，本实验以苹果浊汁为原料，以嗜酸乳杆菌-植物乳杆菌-发酵乳杆菌1∶1∶1为添加复合发酵剂，研究复合菌株发酵苹果浊汁，每隔2 h测定苹果浊汁中的活菌数、乳酸生成量及总糖消耗量变化情况，结果如图2所示。

图2 发酵苹果浊汁动力学曲线Fig. 2 Time-course curves of fermented cloudy apple juice

由图2可知，总糖含量随时间延长呈下降趋势，乳酸含量呈上升趋势，说明苹果浊汁中总糖一直在被消耗减少，乳酸生成量也在逐渐增加。在0～4 h，活菌数几乎没有变化，此时菌体在适应生长环境，4 h后进入对数生长期，适应环境后菌体生长迅速，大量繁殖；16 h后，菌体生长速度减慢，此时进入稳定期，活菌数趋于平稳。

2.2.2 菌体生长动力模型计算