水相体系中磷脂酶A1酶解南极磷虾磷脂制备溶血磷脂的分析

胡 劼，俞博凯，吕 飞，丁玉庭,3，刘书来,3,*

（1.浙江工业大学海洋学院，浙江 杭州 310014；2.国家远洋水产品加工技术研发分中心（杭州），浙江 杭州 310014；3.浙江工业大学海洋研究院，浙江 杭州 310032）

南极磷虾巨大的生物量已受到人们广泛关注，目前对于南极磷虾的商业开发局限于动物饲料等的加工，经济效益低下[1]。研究发现，南极磷虾磷脂的主要成分是磷脂酰胆碱（phosphatidyl cholines，PC），还有少量磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）和磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）等[2]。磷虾油中约60%～70%的ω-3长链多不饱和脂肪酸，主要是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），并且与磷脂结合存在（位于Sn-2位居多）[3]，是目前自然界中发现的唯一一种以磷脂形态结合的多不饱和脂肪酸，而鱼油中的DHA、EPA主要以甘油酯形式存在，因而比鱼油具有更为重要的生理功能[4]。海洋源ω-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），已被证明在预防心血管疾病中发挥有益作用[5-6]。除此之外，ω-3 PUFA还被证实可降低收缩压、缓解血小板聚集、消炎以及预防心律失常[5]。ω-3 PUFA通常以甘油三酯（triglyceride，TG）的形式通过鱼油或者补充剂摄入，而磷虾油中ω-3 PUFA以磷脂的形式存在，能被更有效地吸收并掺入细胞膜中[7]，还可减少血浆脂质[8]、提高EPA和DHA的生物利用度及抗炎和抗氧化活性[9-10]。

溶血磷脂的乳化稳定性、抗氧化性、润湿性及亲水亲油平衡值（hydrophile-lipophile balance number，HLB）都优于磷脂，其乳化体系有抗酸、抗盐以及抗高温等优点[11]。同时，溶血磷脂的分子渗透能力、杀菌能力、溶血能力与药物亲和能力也引起生理药理学家的极大兴趣。目前磷脂酶解的原料主要为大豆和蛋黄等[12-13]，国内外关于南极磷虾磷脂酶解改性制备溶血磷脂的报道较少，因此将其作为原料制备富含EPA和DHA的溶血磷脂，具有更重要的生理功能[14]。国内外溶血磷脂制备工艺通常采用非水相体系[15-16]或含缓冲液的水相体系[17]。非水相体系的酶改性工艺中有机溶剂的使用造成产品中溶剂残留，另外溶剂的易挥发性还导致溶剂消耗大，不符合绿色加工发展趋势；而含缓冲液的水相体系会影响产品的质量及后续处理难度。磷脂酶A1（phospholipase A1，PLA1）可用于水解磷脂酰胆碱制备溶血磷脂酰胆碱，且特异性地水解磷脂酰胆碱的Sn-1位，以制备Sn-2位富含EPA和DHA的溶血磷脂酰胆碱，但Sn-2-溶血磷脂酰胆碱（Sn-2-lysophosphatidylcholine，Sn-2-LPC）也会发生部分酰基位移生成Sn-1-溶血磷脂酰胆碱（Sn-1-lysophosphatidylcholine，Sn-1-LPC）[18-19]。在水相体系中PLA1催化南极磷虾磷脂制备富含EPA和DHA的溶血磷脂，国内鲜见文献报道。本研究以酸价衡量磷脂水解程度，通过高效液相色谱-紫外检测（high performance liquid chromatographyultraviolet，HPLC-UV）仪和高效液相色谱-示差检测（high performance liquid chromatography-refractive index detector，HPLC-RID）仪对酶解前后磷脂组分（PC、Sn-1-LPC、Sn-2-LPC）进行分析，通过高效液相色谱-蒸发光散射（high performance liquid chromatographyevaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）仪检测甘油磷脂酰胆碱（glycerol phosphatidylcholine，GPC）含量以进一步证实酰基位移现象，并利用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GCMS）法分析磷脂酶解前后脂肪酸组成（尤其是EPA和DHA含量的变化），以期为南极磷虾磷脂的酶解改性技术提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾磷脂：以磷虾油（由辽渔集团提供，采用乙醇提取）为原料，经过多次丙酮沉降，磷脂含量90%左右，酸价10.7 mg/g；磷脂酶A1（Lectise Ultra，酶活力2 000 U/g） 丹麦诺维信公司；无水乙醇、乙醚、丙酮（均为分析纯） 上海凌峰化学试剂有限公司；氢氧化钾、邻苯二甲酸氢钾（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；正己烷、草酸（H2C2O4·2H2O）、异丙醇、95%乙醇、乙酸（均为色谱纯） 美国阿拉丁公司。

1.2 仪器与设备

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 杭州博研仪器设备有限公司；RE-2000A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（III）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；FA1004型电子天平 常州市幸运电子设备有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；DHG-9075电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；TRACE 1300 GC-MS谱仪赛默飞世尔科技公司；1525液相色谱仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 PLA1酶解南极磷虾磷脂制备溶血磷脂

准确称取0.6 g南极磷虾磷脂于100 mL锥形瓶中，加30 mL去离子水均质分散，确保反应体系为水相，再加一定比例PLA1溶液，预混匀后，在一定温度、时间及搅拌速度下进行反应，反应完成后沸水灭酶3 min，留样待测定。

1.3.2 双相薄层色谱定性分析磷脂组成成分

参考AOCS Ja 7-86[20]的方法测定，稍作修改。点样：取样品50 mg溶解后定容于10 mL容量瓶中，使用10 μL微量进样器进行点样，样点距两边约1 cm，样斑直径不超过3 mm。层析步骤：将点过样的薄板挥干溶剂后放入盛有展开剂A（氯仿-甲醇-氨水，65∶30∶4，V/V）的层析槽中进行展开。展至距板上沿1 cm左右时取出，在室温下干燥30 min，挥干溶剂后再放入展开剂B（氯仿-甲醇-冰醋酸-水，170∶25∶25∶6，V/V）中展开，至顶边1 cm左右时取出，再次晾干。显色：将挥干溶剂的层析板放入碘缸中显色。薄层层析板定性分析：将磷脂实验产品按照上述步骤展开，显色。参照PC、PE、LPC标样图谱和资料中的图谱，对各磷脂组分进行定性。

1.3.3 磷脂酸价的测定

参考AOCS Ja 6-55[21]的方法测定，稍作修改。取干净250 mL锥形瓶，用天平称取0.5～3.0 g磷脂样品，加入乙醚-异丙醇混合液50～100 mL和3～4 滴百里香酚酞指示剂（2%），充分振荡溶解试样。再用标准氢氧化钾（0.1 mol/L）溶液进行手工滴定，当试样溶液变为蓝色时，且15 s内无明显褪色时，为滴定终点。记录下此时消耗的氢氧化钾的体积V。同时做一组空白实验作对照，记录体积V0，按公式（1）计算酸价：

式中：XAV为酸价/（mg/g）；V为试样测定所消耗的标准滴定溶液的体积/mL；V0为相应的空白实验所消耗的标准滴定溶液的体积/mL；c为标准滴定溶液的浓度/（mol/L）；56.1为氢氧化钾的摩尔质量/（g/mol）；m为油脂样品的称样量/g。

1.3.4 磷脂水解度的计算

磷脂水解度按公式（2）、（3）计算：

式中：X为磷脂Sn-1位脂肪酸水解度/%；A为水解产物酸价/（mg/g）；B为原料酸价/（mg/g）；C为磷脂Sn-1位完全水解产生的理论酸价/（mg/g）； 为磷脂平均相对分子质量。

1.3.5 磷脂各组成成分的HPLC-UV分析[22]

色谱柱：Sunfire Prep Silica（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流速1 mL/min；检测波长206 nm；流动相为正己烷-异丙醇-0.05%乙酸（6∶8∶1.38，V/V），过0.22 μm有机膜，超声脱气处理30 min；进样量10 μL。样品的定性分析采用标样保留时间比对，定量分析采用标样外标法。

1.3.6 磷脂酶解后GPC含量的HPLC-ELSD分析[18]

色谱柱：Sunfire Prep Silica（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30 ℃；漂移管温度80 ℃；流速1 mL/min；梯度洗脱：流动相A为甲醇-水（8∶1，V/V），流动相B为甲醇。流动相A的梯度洗脱，开始10 min，以40%梯度增加到60%并保持5 min，最后3 min由60%降低到40%；进样量10 μL，样品的定性分析采用标样保留时间比对，定量分析采用标样外标法。

1.3.7 Sn-1-LPC和Sn-2-LPC含量的HPLC-RID分析

参考GB/T 22506—2008《酶改性磷脂中1-和2-溶血磷脂酰胆碱的测定》[23]中方法。色谱柱：Waters spherisorb NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温25 ℃；进样量10 μL。等度洗脱，流动相为95%乙醇-草酸溶液（92:8，V/V），过0.22 μm有机膜，超声脱气处理30 min，流速1 mL/min。示差检测器检测峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），标样质量浓度为横坐标（X，mg/mL）进行标准曲线的绘制。

样品处理：称取50～100 mg酶改性磷脂样品，用95%乙醇溶解稀释至25 mL，用高速离心机离心（8 000 r/min，10 min），取上清液用0.45 μm纤维膜过滤，现配现用。

1.3.8 磷脂脂肪酸组成测定[24-27]

采用薄层制备板分离磷脂和游离脂肪酸。带状点样后，以正己烷-乙醚-冰乙酸（80∶19∶1，V/V）为展开剂进行展层，显色，刮板收集磷脂层和游离脂肪酸层，用无水乙醇萃取硅胶中的磷脂和游离脂肪酸，氮吹挥干溶剂，得到样品。

样品甲酯化：在样品中加入1 mL 0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液，摇匀后于80 ℃水浴振荡5 min，冷却至室温后，再加入1 mL 14% BF3-甲醇溶液和0.3 mL 0.1%对苯二酚溶液，在80 ℃水浴中振荡2 min，冷却至室温后加0.2 mL盐溶液，振荡10 s后加入1 mL正己烷，振荡摇匀后静置。待分层后取含脂肪酸甲酯的上层溶液，加入一定量无水硫酸钠脱除水分，使用0.22 μm孔径有机相滤膜过滤后进行GC-MS分析。

GC条件：HP-INNOWax毛细管柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气；采用恒流模式；流速为2 mL/min，不分流；进样量1 μL；进样口温度240 ℃；检测器温度250 ℃；柱温以初始温度90 ℃保持5 min，先以15 ℃/min升至200 ℃，再以1 ℃/min升至240 ℃并保持10 min，整个分析过程为62.3 min。MS条件：GC-MS接口温度250 ℃；电子电离源；电离能量70 eV；离子源温度250 ℃；扫描周期，0.2 次/s；质量扫描范围m/z 35～450 u。

1.3.9 酶解前后磷脂乳化稳定性测定[28-29]

配制一定量1%酶解后磷脂水溶液，然后按一定油水比加入大豆油，经高速剪切机（10 000 r/min）分散2 min，得乳状液。将乳化液转移到100 mL具塞量筒中，间隔一定时间观察分层情况，并与磷脂原料作比较。以乳化层比例大小衡量乳化能力和乳化稳定性，乳化层比例越大，乳化能力和乳化稳定性越好，按公式（4）计算：

1.4 数据分析与处理

数据结果采用Origin 8.6进行处理。所有实验平行测定3 次以上，结果以±s表示。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾磷脂的组成分析

用双相薄层色谱法对原料磷脂中的主要组分进行定性分析，结果如图1所示。采用乙醇提取的磷虾磷脂中主要含有PC、PE、LPC等物质，且从显色面积来看，PC为主要成分。

图1 原料磷脂双相薄层展开图Fig. 1 Two-dimensional TLC profile of phospholipids

用HPLC-UV对南极磷虾磷脂主要组分进行定量分析，由表1可知，实验室自提的南极磷虾磷脂中PC为主要成分，其含量为（90.90±1.55）%，PE和溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）含量分别为（3.20±1.03）%和（2.60±0.96）%。孙德伟等[30]用亚临界丁烷提取南极磷虾脂质，其磷脂含量较高，但磷脂酰胆碱仅占71.20%，其PE和PI含量相对较高。这是由于脂质提取所用溶剂不同，PE在乙醇中溶解度小，而磷虾中PI含量本就偏低，因此本研究以PC为实验主要原料进行分析。

表1 南极磷虾磷脂各组分的含量Table 1 Composition of Antarctic krill phospholipids%

2.2 反应时间对磷脂酶解的影响

图2 反应时间对磷脂酶解的影响Fig. 2 Effect of reaction time on phospholipid hydrolysis

考察反应温度30 ℃和加酶量20 U/g条件下不同反应时间对磷脂酶解过程的影响，如图2所示，随着反应时间的延长，酶和底物接触次数增多，磷脂逐步被水解产生溶血磷脂和游离脂肪酸，其酸价随之不断升高，30 min后反应趋于平衡状态，酸价增加不明显。PC经PLA1酶解后主要生成Sn-2-LPC，且随时间的延长，PC含量不断减少而Sn-2-LPC含量不断增加，30 min后两者含量趋于平衡，同时Sn-1-LPC含量随反应时间延长呈先升高后逐渐降低的趋势，这是由于酶解过程中部分Sn-2-LPC发生酰基位移生成Sn-1-LPC，而Sn-1-LPC又进一步被PLA1酶解生成GPC[18-19]。

2.3 加酶量对磷脂酶解的影响

一般情况下，酶添加量较低时酶活力随其添加量的增加而增多，底物与酶活性中心接触的机率也随之增加，酶反应速率加快，但随酶添加量增至一定值时，酶反应速率变化不大，甚至还会出现抑制反应的现象[31]。由图3可知，由于初始时加酶量较少，酶不能充分催化底物，当加酶量增加时，酶与底物的接触面积增大，酸价增加较快，而当加酶量达到20 U/g时达到饱和状态，反应处于平衡，继续增大加酶量，水解程度无明显提高。

图3 加酶量对磷脂酶解的影响Fig. 3 Effect of enzyme dosage on phospholipid hydrolysis

2.4 反应温度对酰基位移的影响

图4 反应温度对酰基位移的影响Fig. 4 Effect of reaction temperature on acyl migration

图5 PLA1水解PC示意图Fig. 5 Schematic of the hydrolysis process of PC by PLA1

图4 给出了不同反应温度下酶解反应过程中下Sn-1-PC和Sn-2-PC含量的变化。结合图2中反应时间对酶解影响的结果可知，在不同反应温度下，酶解过程中均发生酰基位移现象，PLA1水解PC示意图如图5所示。张康逸等[32]通过定量13C NMR证明了PLA1具有水解磷脂Sn-1位酰基脂肪酸的专一性，证实了Sn-2-溶血磷脂酰胆碱（Sn-2-lysophosphatidylcholine，Sn-2-LPC）的Sn-2位酰基会通过酰基转移到Sn-1位生成Sn-1-溶血磷脂酰胆碱（Sn-1-lysophosphatidylcholine, Sn-1-LPC）现象的存在，且研究了温度对酰基位移的影响，从实验结果可知随温度升高酰基位移程度逐步升高（反应时间6 h）。从图4可知不同温度下反应30 min后Sn-1-LPC含量几乎没有差异，且GPC含量也没有升高，说明在较短的酶解时间（30 min）内，温度对酰基位移的影响不是很大。

2.5 南极磷虾磷脂酶解前后脂肪酸组成分析

表2 南极磷虾磷脂酶解前后脂肪酸组成分析Table 2 Fatty acid composition of phospholipids before and after enzymatic hydrolysis%

从表2可以看出，酶解后磷脂的脂肪酸组成中EPA和DHA含量几乎没有变化，而游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）中EPA和DHA含量有所上升，且酶解后磷脂的不饱和脂肪酸含量有所降低，饱和脂肪酸含量有所上升。说明在酶解过程中，有部分EPA和DHA被水解下来，但由于磷脂中EPA和DHA含量几乎没有变化，很有可能是结合在Sn-1位的EPA和DHA被酶解下来，也有可能是少量PE上的EPA和DHA被酶解下来，且其他不饱和脂肪酸也被酶解下来，所以导致酶解后磷脂中饱和脂肪酸含量升高。结合图2时间对酶解影响的结果，可以得出酶解后得到的Sn-2位溶血磷脂中EPA和DHA含量较高[25-27]。

2.6 酶解前后磷脂乳化稳定性

图6 酶解前后磷脂的乳化稳定性Fig. 6 Emulsion stability of phospholipids before and after enzymatic hydrolysis

从图6可以看到，酶解后磷脂的乳化稳定性得到提高，且随着时间的延长，稳定性优势越明显。这主要是由于磷脂被PLA1水解后生成了亲水性更强的溶血磷脂。这是由于酶改性南极磷虾磷脂保留了普通磷脂的双亲两性结构，并且由于非极性基团的减少而增强了亲水性能[33]，由此溶血磷脂一定程度上改变了由于HLB值偏小而致普通磷脂应用范围受限制的状况，更加适合用作O/W型乳化剂[34]。

3 结 论

在水相体系中利用LPA1酶解南极磷虾磷脂得到富含EPA和DHA的溶血磷脂。结果表明：加酶量对酸价的影响呈现先上升后下降的趋势。随着酶解时间的延长，Sn-2-LPC含量先增加后趋于平衡（30 min），Sn-1-LPC含量先升高后降低，这是由于部分Sn-2-LPC发生酰基位移生成Sn-1-LPC，而Sn-1-LPC又进一步被LPA1酶解生成GPC，且在较短酶解时间内，温度对酰基位移的影响不大。最后通过GC-MS分析得出酶解产物Sn-2-LPC中EPA和DHA含量较高，且其乳化稳定性也得到提高。