系统生物学驱动的小分子代谢组学策略创新驱动中药现代研究＊

徐 欣，张文华，罗夏琳，刘京净，王天宇，张 宁，孙慧峰，吕海涛＊＊

（1.黑龙江中医药大学药学院 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学佳木斯学院 佳木斯 154007；3.上海交通大学系统生物医学教育部重点实验室和系统生物医学研究院 上海 200240）

代谢组学创始于20世纪初期，是一种由全新的系统生物学理念驱动下，借助质谱和核磁等高通量仪器平台，精准表征生命体对于外源或内源的刺激产生相应代谢动态变化反应的定性定量方法[1]。基于近20年的科学内涵拓展与外延实践应用，代谢组学已经被宽口径应用于生命科学领域。代谢组学不仅可以通过特征小分子化合物辨别植物物种或研究植物生长发育[2,3]，而且能通过特征性代谢修饰与调控分析广泛应用于包括中枢神经、心血管、呼吸系统、内分泌、消化系统、生殖泌尿系统甚至是癌症等[4-10]多种人类复杂疾病早期预警诊断和发病机理研究。此外，代谢组学已经有效应用于现代药物研究[11]和相关毒理学研究[12]。经过多学科的交叉融合发展，代谢组学已经突破原有生物机体的宏观系统生物学研究，扩展至低等微生物和单个细胞的研究[13,14]。科学家正在寻求将代谢组学与上游的基因组学和蛋白质组学技术联姻应用[15,16]，更好的解决生物医药领域的多种复杂关键科学问题。

中医药是经过几千年的临床实践，根据不同时期人类实际疾病病理的整体表达性状特征的总和，经过个性化辨证施治和遣方用药，发展形成的一种独特的传统医药理论和应用体系。而中药是中医临床实践的主要用药形式，其固有化学物质组成的复杂性与作用模式的系统性，与代谢组学秉承的系统生物学理念深度契合，因此当下代谢组学已经广泛应用于诸多中药关键科学问题的解决，如中药药效物质基础辨识，中药质量控制评价，中药作用机理，中药配伍规律等（图1）。

图1 基于系统生物学理念的小分子代谢组学策略应用于中药现代研究

1 代谢组学系统表征中药的化学物质组/药效物质基础

中药是中医临床遣方用药的主要物质形式，其固有化学物质组成非常复杂，这些化学物质是结构多样化的药用植物的次生代谢产物，按其合成途径的不同，主要包括黄酮类、萜类、生物碱类、香豆素、木质素类、有机酸类和酚类等小分子化合物[17,18]。而对中药化学物质组成的科学认知是中药现代研究最重要的一环，将有助于中药质量控制、作用机制、配伍规律等诸多关键科学问题的解决和助推现代临床应用。鉴于中药所含这些小分子化合物呈现多样复杂性，而且中药于临床应用中多以由几种或者几十种中药饮片相配伍而成的中医方剂为主要用药形式，因此，传统天然药物化学研究方法已经无法满足高效表征中药化学物质组的紧迫需求。大量实践证明，具有复杂基质小分子代谢组高效表征的代谢组学分析策略，是当下表征中药化学物质组的优势方法，具有广泛的应用前景。赵新峰等[19]采用代谢组学方法一次性识别检出六味地黄丸中的40种特征性化学成分。以代谢组学理念为方法学基础，王喜军教授团队[20]采用高效灵敏的超高效液相-电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱首次报道了六味地黄丸中50种化合物的信息。另外，李睿等[21]也采用气相-质谱联用和超高效液相色谱联用两种仪器手段研究麻黄汤的化学物质组，分别有效表征40个和39个特征小分子化合物。这些实例都表明代谢组学策略用于中药化学物质组研究的科学性与可行性。然而，如何阐明已鉴定出的化合物是否对靶向疾病具有质量作用，即是否为载体中药的药效物质基础，这又是一个新的方法学挑战。王喜军教授团队[22]对此提出了一种新的中药现代研究思路和方法—中医方证代谢组学。此方法将代谢组学与中药血清药物化学研究方法相整合，更科学直观地从生物效应的角度阐明中药药效物质基础。例如王喜军教授团队[23]对茵陈蒿汤首先进行体外成分检测鉴定，接着通过口服喂药后在大鼠体内检测并鉴定对比出了包含有机酸、环烯醚萜类、香豆素类、黄酮类等21种的化合物，其中19种为体外检测得到的原始形式化合物，2种为代谢产物。另外，他们还对治疗肾阳虚证的男仕胶囊进行了研究，不仅确定了咖啡酸等8种化合物为其药效物质基础，还初步阐释了这些化合物的作用方式和途径[24]。卢盛文等[25]也利用此研究方法，从复杂的化学物质组中系统表征木质素和人参皂苷类等成分为生脉散方剂预防老年痴呆的药效物质基础，同时还表明了与老年痴呆发生发展密切关联的小分子生物标志物和关联修饰代谢通路，为后续的组分中药的药效和成药性评价奠定科学基础。目前，以代谢组学为驱动内核的中医方证代谢组学策略正广泛应用于不同中药的化学物质组与药效物质基础创新研究。

然而，由于中药固有化学物质组成的极端复杂性，中药的化学物质组与药效物质基础研究仍存在居多挑战，有待研究方法与策略的进一步创新。聚焦组分精准鉴定，以功能表征为导向的精准修饰代谢组学策略[26]，或许为当下解决中药复杂性的一个全新方法学选择。该方法的核心理念是首先精准表征载体中药/药物的化学物质组，继而对其中功能组分进行靶向聚焦研究，最终从体内外化学代谢共修饰角度阐明载体中药的有效成分，作用靶点和作用机理，切实为组分中药的现代化研究提供全新方法学策略和科学基础。尽管该策略的若干方法学问题仍有待进一步完善和解决，但前景看好。

2 代谢组学创新助力中药质量控制研究

中药临床有效性的好坏，完全取决于载体中药的系统质量。由于中药化学物质组成的复杂多样，其质量控制方法与实践研究一直是中医药学家开展现代中药研究最重要的一环，也是中药现代化研究诸多领域中最具挑战性的领域。影响中药系统质量的因素颇多，如不同中药品种在其生长发育过程中会受到不同环境因素的显著影响，其化学物质组成必然会发生显著变化[27]，这将决定中药饮片及其成药的系统质量，必将制约其临床有效性的客观表达。基于科学家知识储备的丰富程度，以及对中药客观复杂性的认知水准，中药系统质量控制研究经历从简单的采取单一且高含量的化学成分来定量表征中药质量[28]，发展到基于色谱联用技术建立中药材整体质量指纹图谱配合“一测多评”的方法来系统评价中药质量[29-31]。尽管，思想认知的改变和方法的系统化升级，但单纯靠指纹图谱去认知中药的复杂化学物质组成，进而客观控制中药的系统质量，其无论是在检测化学成分的种类/数量，还是聚焦成分的有效定性和相对定量，以及活性对应性方面，仍存在明显的缺陷。系统生物学驱动的代谢组学方法，锁定特异性的生物标记物来作为制定中药质量控制因子的新策略，显著提升了中药质量控制评价体系的科学性和实用性。目前该方法已经被越来越多的中医药学家用于载体中药的质量评价与控制。如Shu等[32]利用代谢组学结合血浆药理学方法，对四种柑橘药材活性次级代谢物群聚焦定量表征32种特征性小分子代谢物，成功应用于目标中药材的质量评价与品种分类，这将为临床基于该类药材的中药合理使用提供科学选择基础。此外，Jiang等[33]利用代谢组学分析方法，以厚朴药材中厚朴酚、和厚朴酚两种标志性的活性化合物为检测对象，对其进行定量表征，有效地对来自18批厚朴药材的药用来源进行区分辨识，表明这两种活性化合物可成功作为质量标志性物质用于厚朴类中药材的系统质量控制。同理，Wu等[34]采用代谢组学方法，聚焦表征泽泻药材中的三萜类化合物，建立特征化学组分为导向的中药质量控制方法，实践证明该方法可成功应用于不同产地泽泻类中药材质量优劣的辨别，笔者深信这将为其临床使用提供质控参考，确保临床有效性的最大程度发挥，改善病人群体健康。

图2 中药及复方制剂的Q-marker研究思路及步骤[35]

鉴于中药质量控制的必要性和紧迫性，天津药物研究院刘昌孝院士领导的学术团队基于多学科理论与实践系统提出一种中药质量控制的新理念——中药质量标志物（Q-Marker）[35]（图2）。其内涵是根据中医药理论，结合药物中小分子化合物的生物活性功能，确证中药材及复方制剂中与质量高度关联具有高度特异性的中药质量标志物，基于此对中药质量进行有效控制。其核心研究方法是通过系统生物学等现代科学方法，从药物的有效性、特异性、传递性和溯源性以及配伍等方面全面解析、表征和界定中药质量标志物,多途径地锁定和规范中药质量[36]。张铁军等[37]基于此研究理念，采用代谢组学方法结合化学成分生源途径分析以及药性、药效与药动学研究成功建立了以延胡索甲素、延胡索乙素、黄连碱等7个化合物为标准的延胡索的中药质量标志物（Q-Marker）体系，可用于延胡索类药材质量的客观高效控制。此外，武欣等[38]通过代谢组学拟合动力学参数的评价方法对大鼠脑组织中元胡止痛方的成分进行系统研究，确定延胡索甲素、延胡索乙素、原阿片碱、欧前胡素和异欧前胡素为元胡止痛方的核心Q-marker，可用于该中药的科学质量控制，指导工业生产和临床实践应用。

总之，中药质量的科学控制与评价是中药发挥临床疗效与实践应用的最关键一环，是中药现代化与国际化进程中不可忽视的关键科学问题。尽管代谢组学和Q-Marker等全新研究理念与策略的客观化引入，使得中药质量控制研究取得了巨大进步，但面对中药化学物质组成的复杂性与质量评价过程的系统性，中药质量控制仍有很多关键难题尚需克服，如有效成分的辨识问题，药效生物标记物的发现问题，药效与中药质量的对应性问题，不同类型中药成品的质量控制问题等。但我们有理由相信这些科学难题的解决，需要多学科交叉融合，不同学科团队的共同努力，终究会破解中药质量控制这一行业难题，也必将带动中药其他关键科学问题的科学解决。

3 代谢组学整体破解中药毒理作用表型

早在《神农本草经》就提出，“药物应奏效为止，取效为度”的主张来避免药物对人体产生的毒副作用。同理，药物的现代研究与临床应用过程中，药物毒性的评价与表征也是医药学家高度重视的问题。中药固有化学物质组成的复杂性，使其毒性物质基础不明和毒性机理不清，严重影响对其毒性的客观认识和控制，进而影响中药创新药物研究的现代化进程。近年来，以分析表征复杂基质小分子代谢物，表征其功能见长的代谢组学策略被广泛应用于中药毒理研究，阐明载体中药的毒性物质基础和致毒机理[39-41]。例如，研究表明马兜铃酸是中药马兜铃的主要成分，其广泛存在于马兜铃科的系列药材之中，具有很强的肾毒性，但其毒性作用与机理仍不完全明晰[42]。张莉等[43]运用代谢组学方法对马兜铃酸Ⅰ诱导的马兜铃酸肾病进行研究，以期阐明其肾脏系统毒性。结果显示，马兜铃酸Ⅰ作用后，动物体内10种小分子代谢物及其代谢通路发生显著的上调波动，具体包括磷脂、胆汁酸及氨基酸代谢通路伴随肾病的进行发生明显的改变，其活性的表征系统阐明了马兜铃酸的毒性特征与作用机制。此外，Heinrich等基于LC-MS和1H NMR的代谢组学方法对43种常见的药用马兜铃属植物提取液进行活性成分分析及体外毒性评估，结果发现除了常见的马兜铃酸I和马兜铃酸II外，其他的马兜铃酸类化合物也具有肾毒性，这些发现有助于马兜铃的肾毒性机制研究，并对草药的调节具有重要意义[44]。蟾酥作为一种传统中药在临床应用中存在心脏毒性等明显副作用，Kong等基于1H-NMR的代谢组学方法并辅以行为观察，临床化学，心电图记录和组织病理学评估对其心脏毒性机理进行研究，结果发现氧化应激反应，线粒体功能障碍和能量代谢紊乱都与蟾酥引起的心脏毒性有关[45]。此外，梁晓萍等[46]利用代谢组学方法结合心电图分析对蟾酥导致的大鼠急性毒性机制进行研究，结果表明蟾酥毒性可能是通过阻碍自由脂肪酸再酰化或激活蛋白激酶通路干扰了脂质代谢而产生的。

鉴于中药毒性的客观存在，中药合理配伍是制约中药毒性的常用方略，实践证明代谢组学也可用于中药方剂中毒性药物的减毒增效研究。Wang等[47]对牛黄解毒片作用于大鼠后的血浆和尿液进行代谢组学分析，以期理解牛黄解毒片发挥治疗作用的同时，如何通过配伍降低中药雄黄的毒性作用。结果表明，雄黄的毒性减小是由于方中大黄、黄芩、桔梗和甘草等配伍用药共同逆向调节由于雄黄毒性作用引起的大鼠的能量代谢，胆碱代谢，氨基酸代谢以及肠道菌群的扰动和偏离。同理，马致洁等[48]基于大鼠模型，应用代谢组学方法研究雷公藤配伍甘草后的毒性特征和减毒机制，结果显示脂肪酸、甘油酯和甘油磷酸等15个潜在生物标志物和以甘油磷脂代谢为关键的7个代谢通路是雷公藤毒性的作用靶点和靶点群，其毒性发生过程中，引起这些小分子代谢物的生物合成发生明显的扰动，当配伍甘草后，这些代谢修饰被明显恢复，进而从中药配伍角度减轻了雷公藤的系统毒性，增强其治疗活性的客观表达。Li等基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱方法（UPLC/Q-TOF-MS）对马钱子（SNV）及雷公藤（TwHF）诱导的肾毒性雄性大鼠血浆进行代谢谱分析，将SNV组及TwHF组与对照组代谢谱图数据比对分析，分别筛选出了15和17种肾毒性生物标志物，实验结果表明，SNV和TwHF诱导的肾毒性机制存在一定差异，对揭示不同药物肾损伤的机制具有重要意义[49]。

总之，代谢组学从药物与机体的相互作用出发，通过机体代谢的特征性修饰，可以系统理解载体中药的毒性模式与机理，然而当前多是表型层面的研究，尚缺乏对于中药毒性分子机理层面的深层次理解，后续的研究实践中，我们鼓励将代谢组学技术、细胞生物学技术和生物信息学技术有效联姻，突破中药毒理表型研究，深层次阐明其分子机理，为中药配伍过程的增效减毒实践提供科学基础支撑。

4 代谢组学有效解析中药的系统作用

中药系统作用的有效阐明，主要受制于载体中药有效成分的鉴定与表征，否则其作用仍处于一种模糊状态，无法科学解析。代谢组学从机体与药物的体内外小分子的相互作用角度认知药物的系统作用过程，不仅能对中药的系统作用从体内代谢角度进行表征，同时能够有效辨识其作用的核心功能组分。该方法目前已经被有效应用于中药系统作用研究。Xu等[50]利用代谢组学方法研究黄芪治疗类风湿性关节炎的作用机制，通过比较分析表征血液与尿液特征代谢组，发现黄芪主要是通过机制性调节色氨酸代谢，苯丙氨酸代谢，柠檬酸循环代谢和脂肪酸代谢等，而发挥治疗风湿性关节炎的系统作用。Zhao等[51]核心基于代谢组学方法，首先对补肺健脾方的活性成分进行表征，确定11种药草中的145种化合物为活性化合物，其中包括131种易吸收化合物和14种药理活性化合物，同时对该药在人体内的作用靶点进行了分析和预测，对研发更有效的治疗慢性阻塞性肺病的疗法提供了新的途径。随后，整合转录组学和蛋白质组学分析方法，系统阐明补肺健脾方主要通过对机体脂质代谢，炎症反应途径氧化应激和粘着斑的系统调节而发挥治疗长期抗慢性阻塞性肺病的系统作用[52]。此外，王喜军教授团队[53]借助代谢组学技术研究小檗碱防治前列腺癌的系统作用，通过多维代谢组比较研究，发现小檗碱主要通过调节扰动亚油酸代谢，嘌呤代谢，视黄醇代谢，精氨酸和脯氨酸代谢的异常修饰而发挥对前列腺癌的防治作用。

针对中药作用的系统复杂性，简单的研究策略很难科学表征这一领域难题。王喜军教授团队整合中药血清药物化学和代谢组学策略的理念与方法，全新构建中医方证代谢组学研究策略，其优势在于不仅可以快速发现与表征中药的药效物质基础，亦可通过表征证候标记物的活性修饰特征阐明载体中药的作用机理[54]。随后，王喜军教授团队[24]以男仕胶囊为基点，研究其治疗肾阳虚证的药效物质基础和作用机制，他们发现咖啡酸、2-羟基-1-甲氧基蒽醌、1-羟基,2-甲氧基蒽醌、阿魏酸葡萄糖醛酸、木犀草苷等8种化合物为其主要的活性成分，其中木犀草苷、甜菜碱、伞形花内酯等成分通过改善激素合成途径、酪氨酸代谢中激素合成与释放途径和亚油酸代谢中亚油酸合成途径来系统发挥其改善肾阳虚证的作用。此外，王喜军教授团队[55]还以茵陈蒿汤为落脚点，探讨了其在治疗湿热黄疸证的机制机理。他们使用代谢组学技术整体表征体内22种的生物标志物，接着分析其作用靶点，从而发现甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、糖基磷脂酰亚油酸锚定生物合成等是主要的作用渠道。孟宪生等[56]研究川芎治疗寒凝证的作用机制，初步发现N-甲基花生四烯酰胺和二氢神经鞘氨醇等8种寒凝血瘀证潜在生物标志物，通过对生物标志物的功能表征系统阐明中药川芎可能是通过靶向调控磷脂酰胆碱代谢,而发挥治疗寒凝证的系统作用。随后，吕贝然等[57]对川芎复杂成分在体内的变化情况做了整体代谢轮廓的表征，结果发现在体外检测到的17个成分在胃肠道中均保持稳定，可能作为川芎的标识性活性物质，对接下来川芎药效的系统性研究有一定启示作用。

总之，针对中药作用的系统复杂性，代谢组学是当下一种有效的研究策略，能够很好地对其系统作用进行表征。然而鉴于其发挥药效的化学物质的多元性和复杂性，目前，代谢组学研究仅仅是从宏观系统作用角度进行中药作用诠释，很多关键问题仍需要进一步明确，如有效成分的辨识，药物靶点的鉴定，分子机理的阐明等。解决这些关键的科学问题不仅一直是中药现代研究的重大挑战，也是为了更好地推进基于临床特有疗效中药及其方剂的创新组分中药研究，

5 代谢组学诠释中药配伍的优势

图3 系统生物学驱动的多组学整合策略系统研究中药关键科学问题的研究策略

中医临床用药多采用复方配伍用药，配伍的核心价值是增效减毒，如何利用现代科学技术阐释方药配伍的科学性是现代中医药学家面临的重大难题[58,59]。近年来，代谢组学技术作为系统性解决方案被应用于中医方剂配伍规律研究，以期从机体代谢修饰与调控，以及药物药效的表达两个维度认知中药配伍用药的优势与科学性。王喜军教授团队基于大鼠模型，采用药物代谢组学方法研究茵陈蒿汤的保肝作用，初步确定大鼠血中21个药效成分，其中有8个具有保肝作用的活性成分只有在茵陈蒿汤全方配伍的环境下才能被机体有效吸收，进而从代谢角度阐明陈蒿汤配伍用药的优势[60]。再者，李先娜等[61]利用代谢组学方法探讨关黄柏在特定配伍环境下血中移行成分与功效取向的相关性，发现关黄柏在不同方剂配伍环境下入血成分及其代谢物结果均有不同，其中7个化学成分与关黄柏退虚热功效显著相关，6个化学成分与关黄柏清热燥湿功效显著相关，此结果表明不同配伍环境下关黄柏成分在体内吸收各有不同，表明了配伍的优势选择性。Cui等人[62]利用生物化学结合代谢组学方法对黄芩和黄连配伍治疗2型糖尿病的潜在机制进行研究。他们发现大鼠血液和尿液中共14个生物标志物，其功能表征分析表明黄芩和黄连联合用药比单一用药效果更显著的原因是配伍环境下调控MAPK/PI3K/Akt信号通路的作用更显著。同理，Wu等[63]利用非靶向代谢组学方法发现了当归四逆汤可以有效调节表征血瘀综合征的20种生物标记物中的9种代谢产物，涵盖花生四烯酸代谢，甘油磷脂代谢，胆汁酸生物合成和丙酮酸代谢。进一步配伍研究，发现当归四逆汤中的每个活性成分都具有调节这些特征代谢物和代谢通路的作用。然而，评估他们的作用效果时发现，治疗效果均不如全方配伍给药，首次从代谢调控角度阐明当归四逆汤配伍用药的合理性。另外，香附四物汤也是具有活血化瘀功效的配伍组方，由香附、当归、川芎、白芍、延胡索五种中药组成，Liu等[64]也基于非靶向代谢组学的研究方法，以药对为切入点，对香附与其余药物的组合进行了药效配伍规律的研究，他们发现其中香附与当归配伍时活血化瘀的效果最佳，能有效改善血液循环，且这种改善的作用是通过甘油磷脂代谢，类固醇激素生物合成和花生四烯酸的代谢途径而发挥作用的，对药物配伍规律的研究提供的很好的借鉴和指导。黄芩汤已被证明可有效缓解化疗药伊立替康（CPT-11）带来的肠道毒性，因此Cui等[65]基于非靶向代谢组学技术，从黄芩汤的减毒作用阐释其配伍作用的有效性。他们通过研究发现，黄芩汤全方配伍后具有最佳的减毒作用，其中黄芩是发挥减毒作用的主力药物，并且研究者们还表明黄芩汤减轻伊立替康毒副作用的原因有可能是通过甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸途径进行调节的，该研究进一步证明代谢组学对解释中药配伍科学性有重要意义。

诚然代谢组学展示出用于中药复方规律研究的巨大潜力，然而其深层次机制有待进一步阐明，这是未来组分中药研究的关键一环，或许代谢组学整合其他组学策略，细胞生物学方法，实现从配伍表型到功能，再到机理的跨越，切实客观化诠释中药配伍规律的科学内涵，并构建组分中药的配伍模型，用于创新组分中药研究。

6 结论

面向中药现代研究的复杂性与挑战，系统生物学驱动的小分子代谢组学策略呈现绝对的研究理念与方法学优势，可有效用于中药化学物质组、中药质量控制、中药毒理特征、中药系统作用和配伍规律研究。然而，仅以代谢组学为研究手段开展上述制约中药现代化研究与转化应用的诸多瓶颈问题的研究，仍存在巨大局限，目前所得结果与结论仍以代谢表型组表征为主，尚缺乏功能与机理层面的深度挖掘与诠释。未来研究实践中，应将系统生物学驱动的多组学策略深度融合应用（图3），建立更好的研究模式，切实科学地解决上述中药关键科学问题，核心价值是推动中药由饮片配伍进入组分配伍范式，加快组分中药的创新研究与临床应用，让中药更好地服务于病人群体的健康的治疗需要。在健康中国的大环境下，发挥中医药的更大优势和医学价值，真正实现中医药是中国的，也是世界的，让全人类健康受益。