Ce6交联介孔硅纳米粒的制备及其单线态氧产率的测定研究

陈敏 ，康安锋 ，王骐榕 ，王丹 ，杨峰 ,

1.福建中医药大学，福建福州 350122；2.海军军医大学药学院，上海 200433；3.上海长征医院，上海 200433

光动力疗法(PDT)中，单线态氧的生成能力是评价光动力活性的重要因素之一。二氢卟吩(Ce6)是具有较高1O2量子产率的光敏剂，介孔二氧化硅纳米粒是具有较大的孔表面积和良好的生物相容性的纳米载药体系[1]；该课题制备了一种双孔道有序介孔二氧化硅纳米粒，通过化学交联法在孔道表面负载Ce6，利用紫外吸收光谱法来判断载药情况。通过近红外发光法测定1O2的生成和产率，同时研究该系统对黑色素瘤细胞内的杀伤作用和诱导细胞内活性氧产生的能力，以期得到新型纳米载药体系。

1 资料与方法

1.1 试剂与仪器

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和三甲基十六烷基溴化铵(TEOs)及正己烷均购自国药集团化学试剂有限公司，二氢卟吩(Ce6,百灵威科技有限公司)，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)购自美国阿拉丁工业公司，小鼠黑色素瘤细胞（B16，海军军医大学药学院提供），活性氧、CCK8试剂盒，透射电镜，电位测定仪，紫外分光光度计，近红光电倍增管，多功能酶标仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 介孔硅(MSN)的制备 参考文献[2]采用改进Stober方法合成双孔道介孔硅纳米粒，称取0.48 gCTAB溶于240 mL去离子水，滴加2 mLTEOs和10 mL正己烷混合溶液,继续反应12 h,离心洗涤。分散于100 mL无水乙醇和2 mL 5M的HCl混合液，离心洗涤得MSN。在N2保护下滴加50 μL APTES，得介孔改性材料 MSN-NH2。

1.2.2 载Ce6介孔硅 (MSN/Ce6)的制备 称取100 mgMSN加入150 mg N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）和25 mgCe6得MSN/Ce6[3]。

1.2.3 介孔硅纳米粒的表征 采用电位测定仪测定介孔硅的粒径，通过透射电镜 （TEM）观察纳米粒的形貌特征，QuadraSord SI吸附仪测得N2吸附-脱附等温线；计算比表面积分布、孔径和孔容[4]。

1.2.4 紫外吸收光谱测定 样品溶于DMF溶剂，每个样品4种浓度梯度，见表1，记录不同样品的扫描曲线。

表1 紫外吸收光谱测定中不同样品的浓度

1.2.5 单线态氧产率的近红外发光测定 检测1O2的近红外发光信号，定量评估1O2产率[5]。将样品（表2）分别放入比色皿，依次采集5个滤光片的光谱信号，进而鉴别出单线态氧发光信号。比较待测样品与参考标样的1O2（max=1 270 nm）发光强度，计算待测样品的1O2量子产率。

表2 单线态氧产率测定中不同样品的浓度

1.2.6 CCK8法测细胞毒性 取对数生长期B16细胞孵育后加入不同浓度梯度（0.375、0.75、1.5、3、6、12 μg/mL）游离的Ce6、含等量Ce6的MSN/Ce6和空白载体材料MSN，并设空白对照组，每组设3个复孔避光培养。660 nm波长激光照射，光剂量为10 J/cm2，避光培养后每孔加入100 μL含10%CCK8的培养液，2 h后酶标仪测定450 nm处OD值。

1.2.7 细胞内单线态氧产生的检测 取对数生长期B16细胞孵育后加入倍比稀释的游离 Ce6 （0.375～12 μg/mL）、含等量Ce6的MSN/Ce6和载体材料MSN，并设空白对照，每组设3个复孔避光培养。每孔加入100 μL含DCFH-DA活性氧检测试剂的无血清培养基，激光照射后测定各孔的吸光度值[6]。

2 结果

2.1 双孔道介孔硅纳米粒表征

纳米粒的表征结果TEM图（图1）。电位测定仪测定其水合粒径为159.2 nm，zeta电位值为-15.1 mV，材料比表面积为1 356 m2/g，总孔容积为2.40 cm3/g，孔径约为5.62 nm。

图1 MSN纳米粒的结构表征

2.2 吸收光谱检测

通过不同样品的紫外吸收光谱 （图2），发现Ce6、MSN/Ce6在671 nm处有特征吸收峰,表明Ce6成功修饰到MSN-NH2外表面和孔道内表面。

2.3 单线态氧近红外发光检测

近红外光谱分辨图（图3A）显示Ce6和MSN/Ce6在1 270 nm处有发光强度，其中Ce6的发光强度最强。不同样品在1 270 nm处的近红外时间分辨图（图3B）也验证了这点。单线态氧的产率呈现浓度依赖性(图3C)。

图2 载药和不载药MSN纳米粒的紫外吸收图谱

图3 载药和不载药MSN纳米粒的近红外光谱分辨图

2.4 细胞毒性检测

图示（图4A）表明MSN不具有细胞毒性。经光照射处理后（图4B），游离Ce6组和MSN/Ce6均显示较强的光毒作用，呈浓度依赖性。当Ce6浓度达到3μg/mL时，两组均可有效杀伤B16细胞，表明MSN/Ce具有体外光动力抗肿瘤活性。

图4 MSN/Ce6对黑色素瘤B16细胞的暗毒性(A)和光毒性(B)

3 讨论

该课题成功制备了双孔道介孔硅纳米粒，其独特的介孔特性可以高效负载药物。由于Ce6共价交联负载在MSN孔道表面影响直接释放，无法计算其载药量的情况，于是利用紫外吸收光谱法来判定MSN是否成功负载Ce6。MSN与Ce6共价交联后是否仍具有光学活性，具备产生1O2的能力，是值得探讨的问题。利用近红外发光法来测定样品是否产生1O2以及1O2的产率，并选用B16细胞考察MSN/Ce6的细胞毒性和活性氧的产生。在载药纳米体系中检测出1O2的产生，初步说明了MSN/Ce6具有较好的光动力疗效，MSN/Ce6作用B16细胞后表现出显著的细胞毒性和较高ROS的产生，表明载药介孔硅纳米粒具有一定的体外光动力作用。今后，可进一步研究MSN/Ce6的抗肿瘤活性机制等方面。