不同发酵条件对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响

郑晓雅，殷伟伟，张 松，兰 瑛

（1.华南师范大学生命科学学院，广东 广州 510631；2.深圳市汇尚科科技有限公司，广东 深圳 518055）

【研究意义】食用菌多糖是由10个以上的单糖以糖苷键连接而成的天然高分子聚合物，可从食药用真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离得到，是一种具有多种功能的活性多糖［1-3］。柱状田头菇（Agrocybe aegerita）又称为茶薪菇，隶属真菌门担子菌纲粪锈伞科田菇属［4-5］，是集多糖、氨基酸、菌蛋白等多种营养物质及保健食疗于一身的食用菌，其盖嫩柄脆、口感鲜美，可用于烹制各类佳肴，营养成分高，属高档食用菌类。柱状田头菇还具有极高的药用价值［6-7］，有研究表明，柱状田头菇因含有蛋白质、多糖、维生素、生物碱等成分，具有多种重要的生理功能，如抑菌［8］、抗肿瘤［9-10］、抗氧化及延缓衰老［11-12］。其中，多糖是柱状田头菇中最重要的活性成分之一，具有抗氧化、减少肝损伤及提高免疫活性等作用［13-14］。由于食药用菌的固体培养耗时长，从子实体中提取多糖周期较长且较难实现连续化生产。而液体发酵生产周期短，可连续生产，且在发酵液中产生多糖、多肽等多种生理活性物质，类似于子实体的营养成分。因此，利用液体发酵法生产提取制备柱状田头菇多糖是实现其工业化生产的重要途径和方法。【前人研究进展】目前对柱状田头菇的液体发酵研究主要集中于对其菌丝体生物量的研究。刘明等［15］以菌丝体生物量为指标，筛选到适合茶树菇液体培养的培养基为豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%，最适培养温度为26 ℃，适宜起始pH值为6.5；刘敏等［16］以菌丝体为指标，得到最适宜的培养基配方为葡萄糖3.0%、豆饼粉1.0%、酵母膏 0.2%、MgSO4·7H2O 0.1%、KH2PO40.10%， 培养条件为起始pH 6～7、培养温度25～28 ℃、摇床转速150～180 r/min。【本研究切入点】目前对柱状田头菇液体培养产胞外多糖条件的优化研究较少，且已有研究中所用豆饼粉等培养基成分较为复杂，无法保证从发酵液中提取的胞外多糖纯度。【拟解决的关键问题】本文研究了柱状田头菇液体发酵培养基中的碳、氮源及其浓度以及发酵条件对柱状田头菇产胞外多糖的影响，并根据胞外多糖产量优化得到适宜的发酵条件，旨在提高柱状田头菇的胞外多糖产量，为柱状田头菇进一步的开发利用及其多糖工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：柱状田头菇菌株，由华南师范大学生命科学学院提供。

培养基配方：（1）平板菌种培养基配方：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，（NH4）2SO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO41 g，琼脂20g，加水定容至1 000 mL，pH值调至6.5。（2）液体发酵的基础培养基配方：葡萄糖20 g，硝酸钠2 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeCl30.2 g，ZnCl20.1 g，MnSO40.1 g，维生素B10.1 g，Na2HPO41 g，CaCl20.01g，营养液20 mL，加水定容至1 000 mL，pH值调至6.5。其营养液配方：CaCl21.00 g，AlK（SO4）20.01 g，CuSO40.01 g，Na2MoO4·2H2O 0.01 g，H3BO30.01 g，加水定容至1 000 mL。

仪器设备：AB204-N电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；TH-A3560C高压灭菌锅（造鑫企业有限公司）；ZHJH-1109超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）；双层大容量全温度恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；SHZ-D（III）循环水真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；RE-52D旋转蒸发仪（上海市青浦沪西仪器厂）；UV1700紫外-可见光分光仪（日本岛津公司）；H.H.S水浴锅（上海浦东荣丰科学仪器公司）；DL-101-2烘箱（天津市申环实验电炉有限公司）。

1.2 试验方法

按基础培养基配方，转速为180 r/min，培养时间为8 d，进行以下培养条件优化实验。

1.2.1 液体发酵适宜起始pH值筛选 将液体培养基配方用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH调节起始pH 值为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，研究不同起始pH值对产胞外多糖的影响。

1.2.2 液体发酵适宜碳源筛选 用筛选出的起始pH值，分别采用葡萄糖、甘露醇、乳糖、可溶性淀粉、果糖和蔗糖代替基础培养基中的碳源，使培养基中碳元素含量为600 mmol/L，观察不同碳源对产胞外多糖的影响。

1.2.3 液体发酵适宜氮源筛选 用筛选出的起始pH值和碳源，以蛋白胨、NaNO2、NH4NO3、（NH4）2SO4、尿素、L-甲硫氨酸和L-谷氨酰胺代替基础培养基中的氮源，使培养基中氮元素含量为20 mmol/L，观察不同氮源对产胞外多糖的影响，筛选出培养基的最适氮源。

1.2.4 液体发酵适宜碳源浓度筛选 用筛选出的起始pH值、碳源、氮源，分别设定碳源浓度为1、5、20、40、100 g/L，探究不同浓度碳源对产胞外多糖的影响。

1.2.5 液体发酵适宜氮源浓度筛选 用筛选出的起始pH值、碳源及浓度、氮源，分别设定氮源浓度为0.1、0.5、2、5、20 g/L，探究不同浓度氮源对产胞外多糖的影响。

1.2.6 液体发酵适宜转速筛选 用筛选出的起始pH值和碳、氮源及其浓度，分别将摇床转速设置为100、150、180、200、250 r/min，观察不同转速对产胞外多糖的影响，筛选出液体发酵的适宜转速。

1.2.7 液体发酵适宜培养时间筛选 用筛选出的起始pH值、碳氮源及其浓度、转速，进行不同培养时间的选择试验，从试验第4天开始取样测定发酵液中胞外多糖产量，每隔2 d取样测定1次，试验持续16 d，观察不同发酵时间对产胞外多糖的影响，筛选出液体发酵的最适培养时间。

上述试验均按培养基配方制备培养液，将100 mL培养液装入250 mL三角瓶，除了含有甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的培养基采用微孔滤膜及针头式过滤器过滤除菌外，其余培养基高压灭菌（121℃）35 min备用。将菌株转接于平板培养基的培养皿内，制成平板菌种，用同一打孔器（直径为4 mm）在平板菌种的同一半径上打孔，将等量菌栓接入培养基，置于ZHWY-2102型振荡培养箱，在26 ℃、转速180 r/min下避光恒温振荡培养。采用随机分组设计，3次重复。

1.3 测定指标及方法

多糖产量测定：发酵液经旋转蒸发仪浓缩后去蛋白、脱色、醇沉、透析及冷冻干燥，得到胞外多糖。采用苯酚-硫酸法［17］测定总糖含量，计算其相对于葡萄糖的换算因子f：

f=m/ρ0D0

式中，m为多糖质量（μg），ρ0为多糖液中葡萄糖的质量浓度，D0为多糖的稀释因数［18］。

多糖产量=ρ×D×f

式中，ρ为样品溶液中葡萄糖含量，D为样品溶液的稀释倍数，f为换算因子。

所有数据采用SPSS 21.0进行统计，采用Duncan法进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 不同起始pH值对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响

发酵液起始pH值的变化直接影响食用菌菌丝体细胞内pH值的变化，间接影响到细胞内酶的活性，pH值过高或过低都会对某些酶的活性起到抑制作用，从而使菌丝代谢减缓，影响菌丝生长，进而影响菌丝产胞外多糖。一般认为，pH值对酶活性的影响是通过细胞内H+或OH-影响酶蛋白的电荷和解离度，而改变酶的结构和功能来实现的［19］。不同起始pH值对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响见图1，柱状田头菇在pH值4.0～10.0范围内均可生长，且在该范围内均可产生胞外多糖，含量总体都比较平稳，其中pH值7.0时，胞外多糖产量最高、平均产量达0.7244 g/L，故可将柱状田头菇液体发酵起始pH值选定为7.0。

图1 不同起始pH值对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响Fig.1 Effects of different initial pH values on the extracellular polysaccharides produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.2 不同碳源对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响

碳源是微生物生长繁殖所需的营养物质，在细胞中起着重要作用。碳源主要用于供应菌株生命活动所需要的能量，构成菌体细胞及代谢产物，是食药用菌液体培养的主要营养成分［20］。不同碳源对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响见图2，柱状田头菇在含6种不同碳源的培养基中都能生长并分泌胞外多糖，说明柱状田头菇菌丝可利用多种碳源。以可溶性淀粉为碳源时胞外多糖产量最高、达1.395 g/L，极显著高于其他碳源；以甘露醇为碳源时多糖产量较低、仅为0.117 g/L。因此，柱状田头菇菌丝合成和分泌胞外多糖的适宜碳源是可溶性淀粉。

图2 不同碳源对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响Fig.2 Effects of different carbon sources on the extracellular polysaccharide produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.3 不同氮源对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响

氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物，也是食药用菌液体培养的主要营养成分［21］。不同氮源对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响见图3，从图3可以看出，有机氮源和无机氮源均可被柱状田头菇菌丝体吸收、利用进而产胞外多糖。以L-谷氨酰胺作为氮源时柱状田头菇液体发酵产胞外多糖最高、达1.018 g/L，其次是硝酸铵、亚硝酸钠和蛋白胨，三者之间无显著差异。

图3 不同氮源对柱状田头菇产胞外多糖的影响Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the extracellular polysaccharide produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.4 不同浓度可溶性淀粉对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响

碳源浓度影响着菌丝体生长的速度和胞外多糖的产量，不同浓度可溶性淀粉对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响见图4。图4显示，在1～40 g/L浓度范围内，随着可溶性淀粉浓度的增加，胞外多糖产量逐渐增加，可溶性淀粉浓度达到40 g/L时胞外多糖产量最大、为1.183 g/L。但是，胞外多糖产量在可溶性淀粉浓度为20 g/L和40 g/L时差异不显著。当淀粉浓度高于40 g/L时，随着浓度升高，胞外多糖产量下降。因此，淀粉浓度对柱状田头菇的胞外多糖产量影响较大，当浓度较低时胞外多糖产量较低，浓度过高则会抑制菌丝体生长进而影响胞外多糖的产生。因此，可将柱状田头菇液体发酵的可溶性淀粉浓度调控在20～40 g/L之间。

图4 不同浓度可溶性淀粉对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响Fig.4 Effect of different concentrations of soluble starch on the extracellular polysaccharide produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.5 不同浓度L-谷氨酰胺对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响

不同浓度L-谷氨酰胺对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响见图5，在2 g/L浓度范围内，随着氮源浓度的提高，胞外多糖产量逐渐增加。当氮源浓度为2 g/L时，胞外多糖产量达最高、为1.360 g/L，极显著高于其他浓度处理；当氮源浓度大于2 g/L时，胞外多糖产量随氮源浓度的升高反而下降。因此，2 g/L为柱状田头菇液体发酵时L-谷氨酰胺的适宜浓度。

图5 不同浓度L-谷氨酰胺对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响Fig.5 Effects of different concentrations of L-Glutamine on the extracellular polysaccharide produced by mycelia of Agrocybe aegerita

2.6 不同转速对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响

摇床转速与发酵液中的溶氧水平密切相关，限制着菌丝的生长、长势、营养物质利用率、营养成分转化等，转速过高和过低都不利于菌丝体发酵产糖［22］。不同转速对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响见图6，图6显示，当摇床转速为100 r/min时，胞外多糖产量较低；随着摇床转速升高至180 r/min时，胞外多糖产量达到最大值、为0.804 g/L，与其他转速处理的胞外多糖产量相比达到极显著差异；当摇床转速大于180 r/min时，胞外多糖产量急剧下降。因此，柱状田头菇液体发酵的适宜转速是180 r/min。

图6 不同转速对柱状田头菇产胞外多糖的影响Fig.6 Effects of different shaking speed on the extracellular polysaccharide produced by myceliaof Agrocybe aegerita

2.7 不同发酵时间对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响

图7 不同发酵时间对柱状田头菇菌丝产胞外多糖的影响Fig.7 Effects of different culture time on the extracellular polysaccharides produced by mycelia of Agrocybe aegerita

由图7可知，胞外多糖在4～8 d内分泌缓慢，随着菌丝的不断生长而大量合成并分泌多糖，培养到第12天时胞外多糖产量最高，与在其他培养时间处理的胞外多糖产量差异极显著，而后随着培养时间的延长，胞外多糖产量下降。因此，柱状田头菇菌丝体液体发酵产胞外多糖适宜的培养时间为12 d。

3 讨论

在食用菌的液体培养中，pH值是重要的影响因素之一。刘敏等［16］以菌丝体为检测指标对茶树菇液体发酵条件进行探究，得到其液体发酵最适初始pH值为6.0～7.0。陈少英［23］以多糖产量为指标，得到茶树菇液体发酵最适pH值为5.6，而邓超等［24］的研究结果则是保持pH值为自然状态。本研究发现柱状田头菇液体培养产胞外多糖的最适起始pH值为7.0，从结果可知柱状田头菇可在中性及偏微酸的环境下生长，且培养基成分的不同可能影响起始pH值的确定。

前人对桑黄、樟芝等真菌进行液体培养基条件的研究表明，碳源分别为蔗糖和葡萄糖、氮源分别为氯化铵和酵母浸粉时，胞外多糖产量最高，并发现不同种类真菌对碳源、氮源的要求不同［25-26］。陈少英和邓超等探究了茶树菇液体发酵产胞外多糖的碳氮源条件，得出最适碳源为小麦粉和玉米粉、最适氮源为酵母浸膏和酵母粉［23-24］。本研究中，柱状田头菇在多种碳源中均可生长并分泌多糖，说明其可利用多种碳源，其中以可溶性淀粉为碳源时胞外多糖产量最高，其次分别为蔗糖、葡萄糖、乳糖和果糖，且均没有显著差异。对于氮源来说，本试验中以L-谷氨酰胺为氮源时胞外多糖产量最高，其次是硝酸铵、蛋白胨和亚硝酸钠。本研究结果与前人研究结果有较大不同，造成差异的原因可能是前人研究选择的碳氮源均为纯天然来源的有机碳源和氮源，成分较为复杂，可能会对从发酵液中提取的胞外多糖产量产生干扰；而本试验中均选择结构确定的化合物作为碳氮源，导致结果存在一定差异。

此外，在食用菌液体发酵过程中，营养物质浓度过低不能满足菌丝生长的需要，浓度过高则会抑制菌丝生长［27］，因此培养基C/N是一个很重要的参考指标，而适宜的碳源和氮源物质更容易被菌丝分解利用［28］。在适宜的碳氮比条件下，适宜的碳源物质和氮源物质可使菌丝生长良好，影响真菌多糖和脂类的产生和合成［29］。陈群等［30］结果表明，C/N为60时，柱状田头菇菌丝体多糖产量最高，而邓超等［24］研究表明C/N约为6.7时柱状田头菇的多糖产量最高，陈少英［23］结果更低、C/N为2∶1。本研究通过对柱状田头菇碳源、氮源浓度的探究，选定C/N在10∶1～20∶1之间，产多糖较多。这与前人研究结果不同且差异很大，可能是与碳、氮源的浓度和种类有关，利用不同来源的碳源及氮源时，其最适浓度也会不一样。

溶氧是发酵中的另一个重要因素，通过调整摇床转速来控制溶氧量［31］，为菌丝体生长创造适宜环境，可提高胞外多糖的产量。有研究表明，摇床转速为150 r/min时多糖产量最高［23-24］。刘敏等［16］研究表明，摇床转速为150～180 r/min时，茶树菇菌丝体生长最好。本研究中转速为180 r/min时菌丝生长最好、胞外多糖产量最高，说明摇床转速可能是通过影响菌丝球的生长来影响胞外多糖产量。此外，液体发酵周期一般为5～10 d，在此周期内菌丝球生长直径良好、密度高，有利于菌丝产胞外多糖。李炳功等［32］研究发现液体发酵灰树花14 d时多糖产量最高，王储炎等［33］研究发现液体培养黑芝菌6 d时胞外多糖产量最高，本研究中培养时间为12 d时柱状田头菇胞外多糖产量较高，说明不同菌种之间培养时间存在较大差异。

4 结论

本研究确定了柱状田头菇的适宜碳源是可溶性淀粉，其适宜浓度为20～40 g/L；适宜氮源是L-谷氨酰胺，浓度为2 g/L；最适起始pH值为7.0，摇床转速为180 r/min，于26 ℃下培养12 d。在该发酵条件下，柱状田头菇的胞外多糖产量较高、为1.08 g/L，其中多糖含量为71.73%、蛋白质含量为8.62%。研究结果为利用液体发酵工业化生产柱状田头菇多糖提供了理论依据。