4种咖啡叶片叶绿素荧光参数日变化研究

武瑞瑞，黄家雄，杨 阳，李亚男，张晓芳，吕玉兰，何红艳，李贵平

（云南省农科院热带亚热带经济作物研究所，云南 保山 678000）

【研究意义】影响植物正常生长的环境因素有很多，如光照、温度及CO2浓度等。环境胁迫对植物光合作用的影响是多方面的。而叶绿素荧光是光合的探针，能更加真实的反应植物的光合作用。植物叶片叶绿素荧光特性已被广泛应用到植物光合机理和逆境生理等研究领域［1-2］。光合日变化是维持植物光合机构内不同组分响应和适应环境条件的一种平衡能力的反应，叶绿素荧光参数则反映光合机构内一系列重要的适应调节过程［3］。开展咖啡叶绿素荧光日变化的研究有助于了解环境对咖啡光合作用的影响及咖啡对环境的适应方式。【前人研究进展】朱弘等［4］对不同竹龄毛竹冠层叶片叶绿素荧光参数日变化的研究发现，适当提高4年生毛竹在竹林中的比重，通过优化毛竹立竹结构和林肥管理可提高毛竹林经营综合效益。习玉森等［5］研究了不同生长型观赏桃叶的叶绿素荧光日变化，发现生长季内8月上旬PSII中心出现可逆失活，不同生长型叶绿素荧光有一定差异。王直亮等［6］通过研究不同菜心品种叶绿素荧光参数日变化规律，发现随着光强和温度的变化，在一定范围内，PSII可逆性功能失活，且耐热性强的菜心品种恢复速率较高。乔梅梅等［7］研究了不同种植处理与不同环境下黑果枸杞叶绿素荧光参数的日变化，发现垄栽各荧光参数变化幅度小，且荧光参数与光强和温度等环境因子的相关性低，所以黑果枸杞高效种植采取垄栽。韦阳连等［8］研究了龙船花属3种植物叶绿素荧光参数的日变化，发现3种龙船花的光合性能及耐阴性为龙船花＞大王龙船花＞大叶黄龙船花。【本研究切入点】对大粒种、中粒种以及小粒种咖啡卡蒂姆2和卡蒂姆3的叶绿素荧光日变化进行比较，了解它们荧光特性的差异及与气象因子的相关性。【拟解决的关键问题】测定5月份咖啡叶片叶绿素荧光参数Fo的日变化规律及其与温度、湿度、太阳光照强度等影响因子间的关系，有助于了解咖啡对环境的适应性，为选育适宜本地气候特点的咖啡提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所潞江坝基地（98°53′E，21°59′N），海拔720 m，具有典型的干热河谷气候，干湿季节非常分明，雨热同期，冬无严寒，夏无酷暑；11月至次年5月为干季，6～10月为湿季，7、8、9月雨量最多，占全年80%。

1.2 试验材料

大粒种咖啡（Coffea liberica）：咖啡三大原生种之一，原产地为西非的利比里亚，环境适应力强，亦耐病虫害，却是咖啡原生种中品质最差。苦味强烈是其特征。

中粒种咖啡（Coffea robusta）：非洲刚果原产的原生种，较阿拉比卡种（Arabica）耐病虫害（特别是叶锈病），环境适应力亦强，具有特别的“罗布味”（类似烧焦麦子的味道）。

小粒种咖啡（Coffea arabica）：原产地非洲埃塞俄比亚，为三大原生种中质量最佳者，其香味和质量是3种之中最好。卡蒂姆是小粒咖啡中的波旁种系分支卡杜拉与中粒种的混种，种植这个品种的原因是由于卡蒂姆拥有中粒种基因，在抗病性方面比单一老品种强，且产量也好。选取了卡蒂姆系列的2个品种，分别为卡蒂姆系列品种2（以下简称卡蒂姆2）、卡蒂姆系列品种3（以下简称卡蒂姆3）。

大粒种咖啡、中粒种咖啡、小粒种咖啡的卡蒂姆系列品种试材均采自云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所潞江坝基地。

1.3 试验方法

1.3.1 叶绿素荧光参数和叶绿素相对含量的测定取中上部枝条，每个枝条从顶端数第4对叶子为测定对象，每个品种测定5片叶。（1）手持叶绿素测定仪（浙江托普TYS-B）测定SPAD值，于早上9：00进行，每个叶片重复测10次。（2）叶绿素荧光参数用调制叶绿素荧光仪（英国汉莎FMS-2）测定，于9：00开始每隔2 h测定1次，19：00结束。测定时暗适应15 min，测量荧光参数Fo与Fv/Fm从仪器FMS-2中直接导出。

1.3.2 气象资料的搜集 太阳辐射强度、温度和相对湿度由保山潞江坝气象站提供。

试验数据利用Excel2003进行处理，用SPSS19.0软件进行分析，采用Origin8.0作图。

2 结果与分析

2.1 太阳辐射强度和温度的日变化

太阳辐射强度的变化呈单峰曲线（图1），在14：00时达到峰值，9：00—10：00和16：00—17：00分别为光照强度快速上升和快速下降的两个阶段；温度的变化呈“M”型曲线，在14：00和16：00超过42 ℃，9：00—14：00为温度上升阶段，其中9：00—10：00为温度快速上升阶段，温度快速上升阶段和光照强度快速上升阶段相同，在15：00温度稍稍下降，16：00后为温度下降阶段。从表1相对湿度日变化呈现先降低后升高的趋势，最低值出现在14：00，之后逐渐上升。相对湿度变化规律与太阳辐射强度变化规律相同。

图1 温度和太阳辐射强度的日变化（5月10日）Fig.1 Diurnal variation of temperature and the intensity of the solar radiation on May 10

表1 不同时间点空气湿度Table 1 Relatively humidity in different time points

2.2 4个咖啡品种叶绿素相对含量的比较

叶绿素是绿色植物参与光合作用的重要色素，其含量高低反映了植株的光合能力和生长状况［9］。叶绿素含量较高时，有利于植物对光能的吸收利用和转化。SPAD值是一项表征叶片光合活性的指标，与单位叶面积的叶绿素含量显著正相关［10-11］，因此常用其大小来衡量叶片中叶绿素的含量［12］。

从4个咖啡品种在5月份的叶片SPAD测定值（图2）可以看出，中粒种咖啡叶片的SPAD值最高为66.04，大粒种咖啡叶片的SPAD值最低为52.84，卡蒂姆2和卡蒂姆3分别为64.70和64.54，相差不大。邓肯差异性分析表明，中粒种、卡蒂姆2、卡蒂姆3的SPAD值无显著差异，大粒种与这个3个品种均差异显著。

图2 不同咖啡品种SPAD值的比较Fig.2 SPAD in leaves of the various types of coffee

2.3 4个咖啡品种叶绿素荧光参数日变化

2.3.1 初始荧光Fo的日变化 Fo为初始荧光，代表不参与光系统II（PSII)光化学反应的光能辐射部分，其数值与叶绿素浓度和激发光强度有关，而与光合作用光化学反应无关［13］。一般Fo越大，能量利用越低。从图3可以看出，大粒种和卡蒂姆2的Fo日变化趋势呈“M”型，都于11：00达到第1个峰值，分别为330.20和192.20，较9：00分别上升55.35%和12.89%，之后呈下降趋势，其中大粒种于15：00降至波谷183.20，17：00上升，之后又开始下降；卡蒂姆2第2个峰值163.21出现在15：00，但上升幅度小，之后下降。中粒种和卡蒂姆3的Fo日变化呈倒“V”型，但各自的变化规律又不完全一致，这两个品种达到峰值的时间各不相同，分别在15：00和17：00达到最高值，分别为262.60和199.44，较9：00分别上升36.14%和63.27%。

除了卡蒂姆2外，其他3个品种的Fo在19：00均高于早晨水平，说明卡蒂姆2叶片色素吸收的能量用于光化学反应较多。卡蒂姆2在11：00以后Fo低于其他品种，且峰值较低，说明该品种叶片色素吸收的能量用于光化学反应较多，对强光胁迫具有较强的耐受性。在9：00，大粒种的Fo值最大，说明此刻叶片色素吸收的能量用于光化学反应较其他3个品种少。由表2可知，在全天时段中，各品种的Fo差异性不同：11：00，4个品种的Fo品种间存在显著差异；15：00，中粒种与其他3个品种存在显著差异；17：00，中粒种和卡蒂姆3与其他两个品种间存在显著差异（P＜0.05）。

图3 不同咖啡品种叶绿素荧光参数Fo的日变化Fig.3 Diurnal variation of Fo in leaves of the various types of coffee

表2 不同咖啡品种同一时刻Fo的差异性Table 2 Difference of Fo in the different varieties of coffee at the same time

2.3.2 PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm的日变化 由图4可知，4种咖啡的Fv/Fm变化趋势相同，均呈倒“V”型变化，但具体的变化情况不同。在9：00，4个品种的Fv/Fm值均在0.70以上；大粒种的Fv/Fm值在13：00前为0.72，降幅最小，较9：00的0.74降低2.73%，在15：00急剧下降，下降为0.60，降幅为18.63%，之后先快速上升然后缓慢上升；中粒种的Fv/Fm值在13：00达到最低（0.65），较9：00的0.77下降15.43%，之后缓慢上升，15：00的Fv/Fm值（0.67）是4个品种中最高的；卡蒂姆2和卡蒂姆3的Fv/Fm值在15：00降到最低值，分别为0.66和0.65，较9：00分别下降11.45%和14.85%，15：00后Fv/Fm值开始上升，卡蒂姆2先快速上升后上升减缓，而卡蒂姆3先缓慢上升再快速上升，卡蒂姆2和卡蒂姆3的Fv/Fm值在19：00 高于 9：00。

从表3可以看出，4个咖啡品种的Fv/Fm值在9：00和17：00均无显著性差异；11：00和19：00，大粒种的Fv/Fm值与卡蒂姆3差异显著；13：00，大粒种的Fv/Fm值与其他3个品种差异显著；15：00，大粒种的Fv/Fm值与中粒种差异显著。纵观全天不同时刻，中粒种的Fv/Fm值与卡蒂姆2和卡蒂姆3无显著差异。

图4 不同咖啡品种叶绿素荧光参数Fv/Fm的日变化Fig.4 Diurnal variation of Fv/Fm in leaves of the various types of coffee

表3 不同咖啡品种同一时刻 Fv/Fm 的差异性Table 3 Difference of Fv/Fm in the different varieties of coffee at the same time

2.4 气象因子与4个咖啡品种咖啡叶绿素荧光参数的相关性分析

从表4可以看出，大粒种的Fo与相对湿度呈显著负相关；中粒种的Fo与温度、太阳辐射强度呈极显著正相关，与相对湿度呈显著负相关；卡蒂姆2的Fo与相对湿度呈显著正相关；卡蒂姆3的Fo与温度呈极显著正相关，与太阳辐射强度呈显著正相关，与相对湿度呈极显著负相关。各品种的Fo与SPAD值存在一定的相关性，但未达到统计学上的显著相关关系。

表4 4个咖啡品种叶绿素荧光参数Fo及其环境因子的相关性Table 4 The correlation of chlorophyll fluorescence parameters and envionmental factors of four varieties of coffee

从表5可以看出，4个咖啡品种的Fv/Fm均与温度和太阳辐射强度呈极显著负相关，大粒种和卡蒂姆2的Fv/Fm与相对湿度均呈显著正相关，中粒种和卡蒂姆3的Fv/Fm与相对湿度均呈极显著正相关。SPAD只与卡蒂姆3呈显著负相关，与其他3个品种均未达到统计学上的显著相关关系。可见，这4个咖啡品种均对高温、强光敏感，但是采取光保护措施不同，因此对环境的耐受性不同。

表5 4个咖啡品种叶绿素荧光参数Fv/Fm及其环境因子的相关性Table 5 The correlation of chlorophyll fluorescence parameters and envionmental factors of four varieties of coffee

2.5 不同时刻间咖啡叶绿素荧光参数的差异性

从表6可以看出，Fo在一天不同时刻的差异性，大粒种在9：00、15：00与11：00、13：00、17：00和19：00有显著差异，中粒种在15：00与9：00、17：00、19：00有显著差异，卡蒂姆2在11：00 与 13：00、15：00、17：00、19：00 有 显著差异，卡蒂姆3在17：00与9：00、11：00、19：00有显著差异，且这4个品种的Fo差异性均无相同之处。

从表7可以看出，大粒种咖啡在9：00、11：00、13：00、17：00、19：00 的 Fo/Fm 无显著差异，但均与15：00有显著差异；中粒种在9：00与13：00、15：00、17：00有显著差异；卡蒂姆 2在9：00、11：00、17：00、19：00与13：00、15：00均有显著差异；卡蒂姆3在9：00、11：00、19：00 与 13：00、15：00、17：00均有显著差异。

表6 同一咖啡品种不同时刻间Fo的差异性Table 6 Difference of Fo in the same variety at different times

表7 同一咖啡品种不同时刻间Fv/Fm的差异性Table 7 Difference of Fv/Fm in the same variety at different times

3 讨论

叶绿素荧光仪能够快速灵敏、非破坏性的反映植物生理状态及其与环境的关系，是一种理想的光系统探针，可以直接或间接地了解光合作用过程［11］，提供许多有关植物光合生理变化的信息。正常情况下，叶绿素吸收的光能主要通过光合电子传递、叶绿素荧光发射和热耗散3种途径来耗散，这3 种途径之间存在着此消彼长的关系［14］。

导致Fo变化的因素有PSII反应中心的可逆失活和破坏，导致Fo上升，Fo升高越多，表明植物受损伤程度越重；PSII天线的热耗散增加，导致Fo降低，Fo降低说明在叶黄素的循环过程中非辐射能量的耗散有所增强，是植物的保护机制之一［15］。因此Fo值变化可推测反应中心的状况和可能的光保护机制［16-17］。Fv/Fm对环境胁迫较为敏感［17-18］，常用Fv/Fm的降低来表示植物叶片的光抑制，其大小可反映植物PSII受伤害的程度［19-20］。一般来说，在非胁迫条件下，大多数植物健康叶片的Fv/Fm在0.7以上，遭受胁迫的叶片Fv/Fm值下降［21-22］。本研究发现，9：00—11：00，4个咖啡品种的Fo均上升，较9：00上升幅度分别为55.34%、19.01%、12.89%和21.89%，此时大粒种受到的损坏程度较大，对温度较敏感，其保护机制可能主要是光系统II反应中心可逆失活或损伤；在15：00，大粒种的Fo急剧下降到最低值，且在这段时间大粒种的Fv/Fm也下降，说明大粒种发生了光抑制，这可能是增加热耗散增加的原因，15：00后开始上升说明随着光强的减弱，光化学部分的能量减少，导致Fo开始回升。卡蒂姆2的Fo在11：00—15：00先降低在升高，说明植物在温度和太阳辐射强度达到最高值的过程中，主动采取措施降低对自身的伤害；在15：00—17：00降低，说明在此时段内，热耗散增加；17：00以后有所上升，说明光照强度减弱，光反应降低，从而使Fo小范围上升；而Fv/Fm在15：00达到最低值，下降幅度为11.45%。卡蒂姆3的Fo在9：00—13：00上升，说明其光系统II反应中心可逆失活或损伤，而在13：00—15：00基本没变，这是由于13：00和15：00的温度、相对湿度、太阳辐射强度相差不大；15：00 —17：00急速上升，只是由于17：00的相对湿度更低，而温度又有增加，而卡蒂姆3的Fo与温度显著正相关，与相对湿度显著负相关。4个品种的Fv/Fm全天变化趋势是先降低再升高，说明高温和强光下，它们的光合活性受到了抑制，随着温度和光强的降低，其光合机制得到恢复，说明之前受到的伤害是可逆的，是光合机构的保护性反应。

中粒种和卡蒂姆3的Fo与环境因子温度、相对湿度、太阳幅度强度相关性基本相同，卡蒂姆2的Fo只与环境因子相对湿度达到统计学的显著正相关，其余均未达到显著水平。这与中粒种和卡蒂姆3与环境因子的相关性不同，其原因需要进一步探讨。大粒种的Fo只与环境因子相对湿度达到统计学的显著负相关，其余均未达到显著水平。而4个咖啡品种的Fv/Fm均与温度和太阳辐射强度呈极显著正相关，大粒种和卡蒂姆2呈显著正相关，而中粒种和卡蒂姆3呈极显著正相关，且卡蒂姆3的Fv/Fm还与SPAD值呈显著负相关。

SPAD植物营养测定仪是通过测量叶片在两种波长范围内的透光系数来确定叶片当前叶绿素的相对数量，具有实时、快速和无损等特点。本试验结果表明，4个咖啡品种的叶片SPAD值依次为中粒种＞卡蒂姆2＞卡蒂姆3＞大粒种，而一天中大部分时刻的Fo依次为大粒种＞中粒种＞卡蒂姆3＞卡蒂姆2，这与SPAD值高低不一致，且相关性分析显示Fo与SPAD含量的相关性并未达到显著水平。因此荧光参数和光合色素之间的关系需进一步探讨。

4 结论

本试验通过对4种咖啡品种的叶片Fo和Fv/Fm在5月份日变化的研究发现，大粒种主要通过增加热耗散，保护光合机构；其他3种主要是通过PSII反应中心的可逆失活。卡蒂姆2的叶片Fo全天最低，且Fv/Fm降低幅度最小，表明卡蒂姆2的光合效率较高，且卡蒂姆2对温度、太阳辐射强度不敏感，因此更适应潞江坝气候。