在明串珠菌中构建葡萄糖到甘露醇的转化体系

2019-07-04金红星王星彭钰玮

食品与发酵工业 2019年12期

金红星，王星，彭钰玮

(河北工业大学化工学院，天津，300130)

甘露醇(mannitol)是一种具有多种功效的六糖醇，被广泛地应用于医药、食品、化工和电子等行业[1]。目前生产甘露醇的4种方法中，海藻提取法产生大量废水、能耗高、污染严重；催化加氢法在高温高压、金属催化和通氢气条件下进行且产物分离困难[2]；酶转化法需要昂贵的辅酶；微生物发酵法产甘露醇绿色清洁，是产业转型升级的迫切需要。产甘露醇的细菌、酵母和丝状真菌中，进行异型乳酸发酵的细菌(lactic acid bacteria, LAB)比较出色[1]。明串珠菌(Leuconostoc)、酒球菌(Oenococcus)和乳杆菌(Lactobacillus)等[3]异型乳酸发酵细菌，将果糖底物转化为甘露醇。国内外的很多学者[4-8]研究了产甘露醇的发酵工艺。然而，南京工大的ZHANG等[9]认为，发酵法产甘露醇途径经济效益低的原因是发酵培养基成本高、果糖的渗漏而进入中心代谢、甘露醇产率低。因此，本课题组[10-11]通过多基因敲除、mdh(甘露醇脱氢酶)基因敲入改造了染色体，并考察了对肠膜明串珠菌发酵产甘露醇的影响，以相对廉价的蔗糖作为底物时，产率已经达到90%以上。

为进一步提高底物到目的产物的转化率，在肠膜明串珠菌中拟引入同型乳酸发酵细菌产甘露醇的代谢途径，即葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸→甘露醇[1, 12]。明串珠菌的PPK(戊糖磷酸解酮酶)代谢途径存在2种酶的编码基因，即催化葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸的葡萄糖激酶和催化葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸的磷酸葡萄糖异构酶[13]。因此，只要引入催化果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸的甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因(mt1d)和催化甘露醇-1-磷酸→甘露醇的甘露醇-1-磷酸酶基因(m1p)，就可以在明串珠菌中构建由葡萄糖转化为甘露醇的体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)CGMCC1.10327、大肠杆菌(E.coli)DH5α、质粒pUC19，均由本实验室保存；肠膜明串珠菌ATCC8293、植物乳杆菌CGMCC1.2437、食淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)CGMCC1.3395，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 试剂

高保真的DNA聚合酶、T4DNA连接酶：谦泰生物技术有限公司；PCR纯化试剂盒：Axygen公司；限制性内切酶：大连宝生物工程有限公司；氨苄青霉素：Sbase公司。引物由金唯智生物科技有限公司合成(表1)，m1p基因编码序列由生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 培养基与培养条件

大肠杆菌用LB培养基培养，培养温度为37 ℃；肠膜明串珠菌和植物乳杆菌用MRS培养基培养，培养温度为30 ℃。

1.1.4 仪器与设备

Mastercycler®nexus PCR仪，Eppendorf;Gene Pluser XcellTM电转化仪，Bio-Rad；LC-20AD CTO-20A高效液相色谱仪,Agilent。

1.2 方法

1.2.1mt1d-m1p串联体的合成

以植物乳杆菌染色体DNA为模板，利用1对引物mt1d1/mt1d2 PCR扩增mt1d编码序列；以肠膜明串珠菌ATCC8293染色体DNA为模板，利用1对引物ldhA1/ldhA2 PCR扩增D-ldh基因的表达元件；通过重叠延伸PCR将D-ldh基因表达元件和mt1d编码序列连接成为mt1d基因表达盒。

根据GenBank中登录号为AF032462的柔嫩艾美球虫(Eimeriatenella)的m1p编码序列，按照明串珠菌染色体的密码子偏好性优化了核苷酸序列，并委托公司人工合成了DNA序列。利用2对引物ldhA3/ldhA4、m1p1/m1p2，通过重叠延伸PCR合成了m1p基因表达盒。

利用1对引物mt1de1/mt1de2 PCR扩增获得的mt1d基因表达盒序列插入到pUC19的EcoRI和XbaI位点上，命名为pUC19-mt1d。利用1对引物m1pe1/m1pe2 PCR扩增获得的m1p基因表达盒序列插入到pUC19-mt1d的KpnI位点上，成为mt1d-m1p表达盒串联体。

1.2.2 同源重组载体的构建

利用2对引物dtsq1/dtsq2、dtsh1/dtsh2，通过重叠延伸PCR获得的产物插入到pUC19的EcoRI和HindⅢ位点上，成为中间带有XbaI识别序列的葡聚糖蔗糖酶基因的同源重组载体。

利用2对引物aldhq1/aldhq2、aldhh1/aldhh2，通过重叠延伸PCR获得的产物插入到pUC19的EcoRI和HindⅢ位点上，成为中间带有XbaI识别序列的乙醛脱氢酶基因的同源重组载体。

以食淀粉乳杆菌染色体DNA为模板，利用1对引物amyl/amyr通过PCR获得的产物插入到同源重组载体XbaI位点上，成为中间带有α-淀粉酶基因标记的同源重组载体。

以mt1d-m1p表达盒串联体为模板，利用1对引物mtmpl/ mtmpr通过PCR获得的产物插入到同源重组载体的XbaI位点上，成为中间带有mt1d-m1p表达盒串联体的同源重组载体。

1.2.3 突变菌株的构建和验证

参照文献[15]的方法进行明串珠菌的电击转化。通过2次同源重组获得mt1d-m1p表达盒串联体定点插入到染色体的突变菌株。第1次同源重组：用中间带有α-淀粉酶基因标记的同源重组载体转化初始菌株，在平板上获得蓝色的目的菌株，即靶基因失活、带有标记基因的菌株。第2次同源重组：用中间带有mt1d-m1p表达盒串联体的同源重组载体转化第1次同源重组获得的目的菌株，在平板上获得白色的目的菌株，即靶基因失活、定点插入mt1d-m1p表达盒串联体的菌株。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

以染色体DNA为模板，利用1对引物aldhyq/aldhyh进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳验证aldh基因失活、带有标记基因的菌株(Δaldh::amy)和aldh基因失活、定点插入mt1d-m1p表达盒串联体的菌株[Δaldh::(mt1d-m1p)]。

1.2.4 发酵产甘露醇

野生型菌株和突变菌株用发酵培养基[14-15]进行摇瓶发酵20 h，用HPLC测定甘露醇含量。参照文献[16-17]改进的检测条件：检测器为蒸发光散射检测器(ELSD 6000)，色谱柱为Ultimate XB-NH2，流动相为V(乙腈) ∶V(水)=85∶15，流动相流速为：1 mL/min，柱温为40 ℃，漂移管温度为95 ℃，气流流速为3L/min。

2 结果与分析

2.1 mt1d-m1p串联体的合成

第1轮PCR扩增得到了预期长度为177 bp的D-ldh基因表达元件和1 164 bp的mt1d编码序列(图1-A，图1-B)。第2轮PCR通过2个第1轮PCR产物末端的反向互补序列相互退火结合，构建成D-ldh基因表达元件和mt1d编码序列连接在一起的DNA融合体。但是此时该融合体的量比较少，经过第3轮PCR特异性地扩增，成功得到了预期为1 341 bp的mt1d基因表达盒(图1-C)。

M-Marker；1和2-D-ldh基因表达元件；3-mt1d编码序列；4和5-mt1d表达盒。图1 合成mt1d表达盒的重叠延伸PCRFig.1 Overlapping extension PCR for the synthesis of mt1d expression cassette

第1轮PCR扩增得到了预期长度为177 bp的D-ldh基因表达元件和946 bp的m1p编码序列(图2-A，图2-B)。

M-Marker；1和2-D-ldh基因表达元件；3和4-m1p编码序列；5-m1p表达盒图2 合成m1p表达盒的重叠延伸PCRFig.2 Overlapping extension PCR for the synthesis ofm1p expression cassette

第2轮PCR利用2个第1轮PCR产物末端的反向互补序列相互退火结合，并通过8轮循环使2个DNA片段重叠延伸，经过第3轮PCR特异性地扩增，成功得到了预期为1 107 bp的m1p基因表达盒(图2-C)。

将mt1d表达盒和m1p表达盒的串联体连接到pUC19上命名为pUC19-mt1d-m1p，经EcoRI和XbaI双酶切验证结果(图3)显示，得到了预期为2 659 bp的线性pUC19和2 483 bp的插入片段。pUC19-mt1d-m1p的测序结果表明，插入片段序列与预期结果一致。

M-Marker；1-酶切结果图3 pUC19-mt1d-m1p的酶切验证Fig.3 Digestion verification of pUC19-mt1d-m1p

2.2 同源重组载体的构建

通过PCR验证肠膜明串珠菌突变菌株的琼脂糖凝胶电泳结果见图4，由图4可知，2种突变菌株符合预期，即野生型肠膜明串珠菌菌株扩增的片段大小为1 125 bp、Δaldh::amy菌株扩增的片段大小为3 079 bp、Δaldh::(mt1d-m1p)菌株扩增的片段大小为3 417 bp，说明在肠膜明串珠菌中成功构建了葡萄糖到甘露醇的体系。

1-野生型菌株(1 125 bp)；2-Δaldh::amy(3 079 bp)；3-Marker；4-Δaldh::(mt1d-m1p) (3417 bp)图4 PCR验证突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图Fig.4 Agarose gel electrophoresis map of mutant strain’s PCR verification

2.3 甘露醇的产量比较

肠膜明串珠菌不同菌株发酵产甘露醇的产量见图5。

1-20 g/L葡萄糖为底物的Δaldh::(mt1d-m1p)；2-20 g/L蔗糖为底物的Δaldh::(mt1d-m1p)；3-20 g/L蔗糖为底物的野生型菌株；4-90 g/L蔗糖为底物的野生型菌株；5-90 g/L蔗糖为底物的Δaldh::(mt1d-m1p)；6-90 g/L蔗糖为底物的Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::amy；7-90 g/L蔗糖为底物的Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::(mt1d-m1p)；8-90 g/L蔗糖为底物的Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdh Δfk::mdhΔaldh::(mt1d-m1p)图5 野生型和突变型菌株的甘露醇产量Fig.5 Mannitol yield of wild-type and mutant-type strains

从图5可以看出，(1) 以20 g/L葡萄糖为底物时，Δaldh::(mt1d-m1p)的甘露醇产量为2.52 g/L，异型乳酸发酵细菌-明串珠菌中已经构建成功了同型乳酸发酵细菌产甘露醇的代谢途径；(2) 以20 g/L蔗糖为底物时，Δaldh::(mt1d-m1p)(9.69 g/L)的底物到甘露醇的转化率比野生型(7.27 g/L)提高了33.29%；(3) 以90 g/L蔗糖为底物时，定点插入mt1d-m1p表达盒的菌株转化率比野生型提高了很多，多基因敲除菌株[Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdhΔaldh::(mt1d-m1p)]产量最高；(4) 以 90 g/L蔗糖为底物时，双拷贝插入mt1d-m1p表达盒的菌株[Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::(mt1d-m1p)]比单拷贝插入菌株[Δaldh::(mt1d-m1p)、Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::amy]产量高，Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::amy比Δaldh::(mt1d-m1p)产量高，这是dts基因(葡聚糖蔗糖酶)失活造成的。

3 讨论

近年来，本课题组一直从事着产甘露醇明串珠菌的遗传育种工作。为了降低生产成本，以蔗糖代替葡萄糖、果糖作为底物进行了发酵产甘露醇的研究[18]。以蔗糖作为底物时，既可以在肠膜明串珠菌胞外由葡聚糖蔗糖酶催化生成葡聚糖和果糖，又可以进入胞内进行代谢[10]。为了使更多的蔗糖进入胞内进行代谢，删除了单拷贝的葡聚糖蔗糖酶基因(dts)，从而提高了甘露醇的产量[15, 19]。由甘露醇脱氢酶催化果糖转化为甘露醇时，需要NAD(P)H[10]。因此，删除dts(Δdts)的基础上，进一步删除了代谢过程中消耗NAD(P)H的D-乳酸脱氢酶(D-ldh)和乙醛脱氢酶(aldh)编码基因，进而又提高了甘露醇的产量[20]。肠膜明串珠菌中存在多拷贝的葡聚糖蔗糖酶基因[13]，故删除了诱导表达葡聚糖蔗糖酶基因的双组分系统成员-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[21]编码基因(stpk)[10-11]。肠膜明串珠菌中除了存在乙醛脱氢酶基因外，还有乙醛脱氢酶-乙醇脱氢酶双功能酶编码基因[13]，故阻断了PPK代谢途径中乙酰磷酸到乙酰CoA 的反应(催化此反应的酶编码基因为pat)[10-11]。使果糖激酶基因(fk)失活，以便几乎所有的果糖转化为甘露醇[10-11]。将3个拷贝的甘露醇脱氢酶基因(mdh)敲入到肠膜明串珠菌染色体中，以便提高甘露醇脱氢酶的酶活，进而提高产量[10-11]。最终，构建了高产甘露醇的菌株肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdh。为了进一步提高蔗糖到甘露醇的转化率，本研究在Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdh(甘露醇产量为41.0 g/L)基础上，在染色体的aldh位点上定点插入了mt1d-m1p表达盒串联体，从而获得了突变菌株Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdhΔaldh::(mt1d-m1p)(47.26 g/L)，转化率又提高了7%。在前期工作中发现，蔗糖底物为90 g/L时甘露醇产量最高[22]，故本研究采用了90 g/L的蔗糖底物。印度的RESHAMWALA等[12]以质粒形式在大肠杆菌过表达了mt1d、m1p和pxtD，因此进行发酵时必须加入抗生素而保持质粒的稳定性。本研究是在染色体上定点插入(mt1d-m1p)的，发酵时不需要加入抗生素。

开始启动本研究时，企图通过重叠延伸PCR将mt1d表达盒和m1p表达盒串联在一起，但是所有的努力都以失败而告终。这是2个表达盒所采用的相同的D-ldh基因表达元件在重叠延伸过程中相互干扰而造成的。通过PCR扩增第一个基因表达盒片段时，在引物中引入酶切位点识别序列，将第二个基因表达盒片段插入到这一位点，从而将2个表达盒串联在一起了。

本研究通过构建葡萄糖到甘露醇的转化体系，使出发菌株大幅度提高了甘露醇产量，但是改造的菌种还没有达到生产中能够采用的水平。微生物发酵生产甘露醇的方法，能否实际应用的瓶颈是生产成本，故从底物和菌株的遗传育种角度还需要深入研究。例如，以甘蔗汁作为培养基[22]或以菊粉[23-25]作为底物，都可以降低发酵成本。