gata3基因表达与人乳腺肿瘤病理特征的相关性分析

钱卫东, 沈兰芳, 王 婷*, 刘翌超, 石 丽, 李永东

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.宁波疾病预防控制中心，浙江 宁波 315000)

0 引言

根据美国癌症学会的《2018年全球肿瘤统计数据报告》，2018年全球新发乳腺癌病例208.88万人，死亡62.67万人.在中国，女性乳腺癌的乳腺癌发病率、死亡率逐年上升，且逐年趋于年轻化.乳腺癌正成为危害女性健康，影响女性生活质量的最大威胁[1,2].

GATA 连接蛋白3(GATA bingding protein 3，GATA3)，属于GATA转录因子家族，可以作为雌激素受体α(Estrogen receptorα，ERα)调控靶基因的转录必需共调节因子(Co-activator和Co-repressor)调控细胞的PR、pS2、c-fos、C-Mye、cathepsinD、cyclin-Dl和bcl-2等基因的表达，进而调控细胞的增殖和凋亡，调节乳腺导管上皮细胞的遗传分化方向，GATA3的缺失可能与ER-乳腺癌的发生有关，其基因组的多态性及表达的改变会影响乳腺癌的发生发展以及预后[3,4].

Jacquemier J等[5]分析了240例接受激素治疗的ER+乳腺癌患者中GATA3 、Ki67、P53表达与预后效果之间的关联性，结果发现GATA3、Ki67和P53表达水平与接受激素治疗的ER阳性乳腺癌患者的预后显著相关.Mehta R J等[6]发现，GATA3高表达的Luminal型乳腺癌，预后良好，GATA3低表达的浸润性癌预后不良.说明GATA3可以作为备选的肿瘤标志辅助判断乳腺癌的发展及预后.但是GATA3表达与中国女性乳腺癌患者病理特征和预后关系尚不明确，并且传统的免疫组织化学染色方法检测GATA3表达，操作繁琐、周期漫长且易出现假阳性结果，亟需建立快速准确地GATA3临床检测方法，辅助乳腺癌的精准诊断和预后评估.

因此，本研究运用灵敏度高、特异性好及高通量的Taqman探针一步法实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测乳腺肿瘤组织中gata3基因的表达情况，分析其GATA3表达与乳腺癌分子分型及临床病理特征的相关性，为乳腺癌患者的诊断及预后评估提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7购自中国科学院上海细胞工程中心；小鼠抗人GATA3抗体、小鼠抗人β-actin抗体和HRP标记的山羊抗小鼠抗体均购自北京中杉金桥公司；乳腺冰冻组织样采集自于西安交通大学第一附属医院.

1.2 试剂

一步法实时荧光定量反转录PCR试剂盒(Takara)、TRIzol 试剂(Invitrogen)、DMEM培养基(HyClone)和胰蛋白酶(HyClone)、其他试剂均为国产分析纯.

1.3 仪器

二氧化碳培养箱(美国Heraeus)、实时荧光定量PCR仪(ABI PRISM7500)、Nano Drop 2000C 超微量分光光度计(美国Thermo)等.

1.4 方法

1.4.1 细胞系培养及其总RNA的提取

将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7分别置于含10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素的高糖DMEM培养液中，在37 ℃、5% CO2饱和湿度的CO2培养箱中培养至对数生长期，用预冷的PBS洗涤3次，按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，并用Nano Drop2000C超微量分光光度计检测总RNA浓度和纯度，-80 ℃冻存.

1.4.2 gata3基因和内参actb基因引物和探针的设计与合成

选用肌动蛋白(β-actin，actb)为内参基因，从Genebank中下载人源 gata3基因和actb基因的mRNA序列，利用Primer Express 3.0设计引物和探针，设计的备选引物及探针序列用NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中的Primer Blast进行特异性的检查，送上海生工有限公司合成.具体序列如表1所示.

表1 gata3基因的引物和探针序列

1.4.3 gata3基因和内参actb基因标准曲线的制作

将细胞系总RNA稀释至100μg/μL，进行10倍比梯度稀释，使终浓度依次为100μg/μL、10μg/μL、1μg/μL、10-1μg/μL和10-2μg/μL.按照一步法RT-PCR试剂盒(Takara)的说明书，冰盒上配制PCR反应的体系：10μL 2×RT-PCR缓冲液，0.4μL 反转录酶，0.4μL Ex Taq HS酶(5 U/μL)，0.4μL PCR上游引物(10μM)，0.4μL PCR下游引物(10μM)，0.3μL TaqMan探针(10μM)，1μL模板RNA，补充无RNA酶水至20μL.反应体系置于ABI PRISM7500上运行，程序为42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，反转录-95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40个循环的扩增反应.扩增结束后用Real Time PCR 软件对扩增结果进行分析，利用(1+E)-ΔCt法(ΔCt = Ctgata3-Ctactb)计算样本中gata3基因mRNA的相对表达量.若gata3基因与actb基因引物的扩增效率均接近100%，则直接用2-ΔCt计算样本gata3基因相对表达量.

1.4.4 乳腺癌细胞系GATA3表达的Western blot检测

参照Voduc等的方法[7,8]提取MDA-MB-231，MCF7细胞的蛋白，并用Nano Drop2000C检测蛋白浓度；稀释蛋白质至约50μg，取20μL样品加入5μL 5×SDS 上样缓冲液，100 ℃变性5 min；离心取上清，以4%的浓缩胶，10%分离胶进行SDS-PAGE电泳(100 V，恒压电泳2～3 h)；冰浴内100 V恒压转PVDF膜1 h；5%脱脂奶粉室温封闭；加入小鼠抗人GATA3的特异性一抗室温2 h，1×TBST洗膜3次；再加入HRP标记的羊抗小鼠IgG，室温1 h，洗膜3次；用ECL发光液均匀覆盖转印的PVDF膜上，将膜置于分光成像仪中成像，用凝胶图象处理系统记录分析目标条带的表达.

1.4.5 gata3基因在临床乳腺肿瘤样本中mRNA表达检测

收集2013～2014年西安交通大学第一附属医院乳腺肿瘤冰冻组织样本100例，良性乳腺病变组织30例(15例乳腺增生、15例乳腺纤维腺瘤)，以及癌旁瘤旁组织45例.其中87例浸润性导管癌患者均按照2011年St.Gallen国际乳腺癌大会乳腺癌分子分型标准分型，由两位资深病理医师复核切片，明确诊断，并通过查阅电子病历统计整理病人信息.冰冻的乳腺组织样本，采取约5 mm3，用一次性手术刀快速切碎，移入预冷的研钵中，加液氮研磨组织至粉状，参考1.4.1方法提取样本总RNA，按照1.4.3方法检测肿瘤组织样本中gata3基因的表达情况.

1.4.6 数据分析

利用SPSS 19.0对乳腺肿瘤组织中gata3基因表达进行非参数Mann-Whitney检验(双变量)或Kruskall-Wallis检验(多变量)，以p<0.05计为差异有统计学意义，分析gata3基因表达水平与乳腺肿瘤病理参数的相关性.

2 结果与讨论

2.1 引物探针检测准确性及特异性

分别配制gata3、actb基因的扩增体系，对MDA-MB-231、MCF7细胞系总RNA进行检测，结果显示，ER+的MCF7细胞gata3基因mRNA的相对表达量显著高于ER-的MDA-MB-231细胞(1.41E-01 Vs 1.66E-04)，而空白对照(NTC)未出现非特异曲线，vk如图1(a)所示.Western blot结果如图1(b)所示，MCF-7细胞中的GATA3在相应的位置(56KDa)出现了明显的条带，而MDA-MB-231细胞中无可见条带.qRT-PCR的检测结果与GATA3蛋白的表达量相符合，证实设计的引物和探针检测准确性及特异性良好.

(a)gata3基因表达的qRT-PCR结果

(b)GATA3表达Western blot结果图1 人乳腺癌细胞系中gata3基因的表达

2.2 gata3基因qRT-PCR的标准曲线

以10倍比梯度稀释的MDA-MB-231、MCF7细胞株总RNA为模板进行qRT-PCR，结果如图2(a)所示，gata3基因标准曲线呈现良好的线性梯度，扩增斜率(Slope)为-3.335相关系数(R2)为0.998，扩增效率(Eff%)为99.449 %，可用2-ΔCt相对定量法分析目的基因mRNA的相对表达水平，并进一步证实了设计的引物及探针具有良好的特异性.

(c)actb基因的qRT-PCR扩增曲线

(d)actb基因qRT-PCR的标准曲线图2 gata3基因和actb基因qRT-PCR扩增的标准曲线

2.3 gata3基因mRNA异常低表达与乳腺肿瘤的发生、转移及不良预后正相关

2.3.1 gata3基因mRNA异常低表达与乳腺肿瘤的发生正相关

以2.2建立的qRT-PCR方法对收集到的100例乳腺肿瘤冰冻组织样本进行检测，结果表明gata3基因mRNA在瘤旁组织中的表达率高于肿瘤组织(9.1392E-02 Vs 5.0548E-02，p=0.007 1)，如图3(a)所示；gata3基因mRNA在恶性肿瘤浸润性导管癌、浸润性小叶癌、髓样癌相对表达量分别为4.73E-02、2.52E-03、2.41E-02，在良性纤维腺瘤中表达量为6.87E-02，显著高于恶性瘤组织(p=0.002，如图3(b)所示).提示gata3基因mRNA异常低表达可能促进乳腺肿瘤的发生.

2.3.2 gata3基因mRNA异常低表达与ER+乳腺癌的发展转移正相关

实验对87例乳腺浸润性导管癌样本进行了分析，发现gata3基因在不同TNM分期，不同分化等级组织中mRNA表达无显著差异(如表2所示).然而在66例ER+的乳腺浸润性导管癌样本中，gata3基因mRNA的表达在肿瘤体积较大(5.74E-02)，发生淋巴结转移(5.10E-02)、TNM分期较高(5.03E-02)、分化级别高(5.26E-02)的癌组织中显著低于肿瘤体积小(7.86E-02)，无淋巴结转移(8.13E-02)、TNM分期低(6.80E-02)、分化级别低(6.80E-02)的癌组织(p肿瘤大小=0.032；p淋巴结转移=0.000 2；pTNM分期=0.021 5；p分化=0.028 7)(如图3(c)、(d)和表3所示).表明，gata3基因mRNA异常低表达可能促进ER+的乳腺浸润性导管癌进一步发展、转移.

2.3.3 gata3基因mRNA表达与乳腺浸润性导管癌Luminal分型正相关

在87例乳腺浸润性导管癌组织分析中，gata3基因在ER+的Luminal A、Luminal B(HER2+)、Luminal B(HER2-)亚型中mRNA的相对表达量分别为6.53E-02、5.74E-02、5.51E-02，显著高于ER-的HER2过表达型(8.47E-03)和三阴型(4.83E-03)乳腺癌(p=0.000 1).Cakir A等[9]认为GATA3是乳腺中Luminal细胞分化所必需转录因子，GATA3表达与乳腺癌雌激素受体(ER)表达呈正相关，并且与患者的预后相关，而ER是临床乳腺癌诊断和治疗的重要生化标志，大约65%的乳腺癌呈ER+，ER+的乳腺癌患者其组织分化程度高，侵袭性不强，内分泌治疗能够有效的抑制E2诱导的增殖，预后较好.与之相反，GATA3-，ER-乳腺癌通常是低分化的，内分泌治疗耐受，侵袭性更强，预后较差，尤其三阴型乳腺癌对常规化疗药物不敏感，没有特异性靶向药物，疾病进展快，死亡率较高[10-12]，gata3基因mRNA的表达与ER的表达和乳腺癌Luminal亚型显著正相关(rER表型=0.512***，r分型=0.459***，如图3(e)、(f)所示).

(a)组织来源 (b)病理组织分型 (c)TNM分期

(d)肿瘤分化级别 (e)分子分型 (f)ER表型IDC：浸润性导管癌；FIB：纤维腺瘤；MED： 髓样癌 ； ILC：浸润性小叶癌;HYP：乳腺增生图3 gata3基因mRNA的表达与乳腺肿瘤临床病理特征相关性

3 结论

GATA3属于GATA转录因子家族，在多种组织中均有表达，在CD4+T细胞分化发育过程中发挥重要作用.同时，GATA3是雌激素受体α(ERα)复合体中的关键分子，可协助实现ER活化，参与激活下游Ras-Raf-MEK-MAPK、 Src-PI3K-Akt-eNOS信号通路，进而调控细胞的增殖和凋亡，调节乳腺导管上皮细胞的遗传分化方向.

目前，发达国家对GATA3与乳腺癌的临床检测研究相对比较详尽.Ordez N G[13]与Clark B Z等[14]研究发现GATA3不仅与乳腺癌的预后有关，还可能作为乳腺肿瘤的鉴别诊断标记.因此可选择GATA3来鉴别乳腺癌，尤其是在三阴性乳腺癌的ER的丰度及活性、药物敏感性的鉴定[15].

研究结果表明gata3基因异常低表达可能促进乳腺肿瘤的发生.并可能促进ER+的乳腺浸润性导管癌进一步发展、转移.该结果与Asselin Labat M L等[16]的实验结果相符合，证明本研究运用自主设计的引物和探针可用于临床乳腺癌样本gata3基因相对表达量快速检测，对临床浸润性导管癌的诊断、用药治疗和预后判断具有一定参考价值.