一株野生香蘑属真菌的鉴定及其生物学性质

王红艳，孔维祎，王竹青，孟德龙，丁 强，王鸿磊

(中国农业大学 烟台研究院，山东 烟台 264670)

香蘑属(Lepista)隶属于真菌界担子菌门(Basidiomycota)层菌纲(Hymenomycetes)伞菌目(Agaricales)口蘑科(Tricholomataceae)[1-2]。我国主要的种类有花脸香蘑(Lepistasordida)、紫丁香蘑(L.nuda)和灰紫香蘑(L.glaucocana)等，均是名贵的食药用菌，广泛分布于我国的辽宁、黑龙江、吉林、河南、江苏、四川、内蒙古及山东等地[3-4]。

花脸香蘑为香蘑属的1个种，其味道鲜美，营养丰富，子实体蛋白质含量高，氨基酸种类全，人体所必需的8种氨基酸含量丰富[5-7]，脂肪含量较低[8]，并含有丰富的人体必需的微量元素和维生素[9-11]，其发酵液具有抗菌[12]、抗氧化及抗肿瘤等活性[13-14]；子实体有养血、养神、补肝等功效[12]，经常食用对于久病体虚、贫血崩漏和神疲健忘等症状具有良好的治疗效果[15]。目前花脸香蘑主要来自于野外采集，价格昂贵，人工栽培鲜有报道。笔者所在实验室自山东省烟台市牟平区林区内发现并采集到1株香蘑属真菌，为进一步确定其分类学地位，利用ITS和28S rDNA的D1D2区序列测定对其进行分子生物学鉴定并对其菌丝形态及生物学特征进行研究，以期为该菌株的人工栽培及其进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 野生香蘑属真菌 采自山东省烟台市牟平区，保存于中国农业大学烟台研究院食用菌菌种选育实验室。

1.1.2 培养基 1)PDA培养基。土豆浸粉6 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL。2)碳源利用培养基。土豆浸粉10 g，MgSO40.5 g，琼脂20 g，水1 000 mL，碳源分别为2%的葡萄糖、蔗糖、玉米粉、淀粉、纤维素、乳糖、红糖和糖蜜。3)氮源利用培养基。糖蜜20 g，MgSO40.5 g，琼脂20 g，水1 000 mL，氮源分别为1%的豆饼粉、酵母膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、土豆浸粉和0.5%的硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸钾。4)无机盐利用培养基。糖蜜20 g，豆饼粉10 g，琼脂20 g，水1 000 mL，无机盐分别为0.1‰的MgSO4、MnSO4、NaCl、CaSO4、FeSO4、Na2SO4、K2HPO4、KH2PO4、ZnSO4和K2SO4。

1.2 方法

1.2.1 野生香蘑属真菌的采集、分离、菌落和菌丝形态观察及形态学初步鉴定 2017年9月，于山东省烟台市牟平区林地内发现野生香蘑属子实体数个，将子实体表面消毒，取菌柄和菌盖交界处的菌丝组织，接种于PDA培养基平板上，25℃培养得到野生香蘑属真菌菌种。拍照并通过观察子实体的分布情况，菌盖的大小、颜色、形状、质地和表面性状，菌褶着生方式，菌柄着生方式。将菌种接种于PDA培养基平板上，25℃培养，观察菌落形态。挑取菌丝体，用棉兰、结晶紫等染色液制作水浸片，观察菌丝和锁状联合。根据该菌种的形态学指标对其进行形态学初步鉴定。

1.2.2 野生香蘑属的分子鉴定

1)基因组的提取和ITS序列测定。将菌种(编号为HL-ND)接种PDA培养基平板上，25℃培养，刮取菌丝体，利用CTAB法提取基因组DNA。使用真菌内转录间隔区通过引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增基因组DNA的ITS序列，利用28S rDNA通用引物NL1(GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)、NL4(GGTCCGTGTTTCAAGACGG)扩增基因组28S rDNA的D1、D2区。PCR产物送生工生物(上海)股份有限公司测序[16]。

2)序列测定和比对。根据ITS、28S rDNA D1D2区测序结果，登陆NCBI进行Blast序列相似性比，用MEGA5.0进行多序列比对并构建系统发育树。

1.2.3 菌种的生物学特性

1)最佳生长温度测定。用直径8 mm打孔器打取菌落边缘的菌丝块，接种于PDA培养基平板表面，分别于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃培养，定期测量菌落直径，计算菌丝生长量。菌丝生长量=(菌落直径-接种块直径)/2。

2)最佳pH测定。用直径8 mm打孔器打取菌落边缘的菌丝块，接种于pH分别为4.5、5、6、7、8、9、10和11的PDA培养基平板表面，定期测量菌落直径，计算菌丝生长量。

3)最佳碳源、氮源和无机盐测定。用直径8 mm打孔器打取菌落边缘的菌丝块，分别接种于碳源利用培养基、氮源利用培养基和无机盐利用培养基表面，25℃培养，定期测量菌落直径，计算菌丝生长量。

2 结果与分析

2.1 野生香蘑属真菌菌株的形态学鉴定

图1可知，采集到的野生香蘑属菌株子实体呈紫色、肉质，直径2～3 cm，丛生，平展，中部稍凹陷，水渍状；菌柄中生，与菌盖同色；菌褶淡紫色，稀疏，不等长。从图2可知，花脸香蘑HL-ND菌落呈圆形，蔓延生长，棉絮状，质地疏松，菌落表面同心轮纹。菌落淡紫色，中心颜色略深于四周，不产水溶性色素。经显微镜观察，花脸香蘑HL-ND菌丝多分支，直径(3.5±1.5)μm，常自体缠绕或相互缠绕形成菌丝束或菌丝球，具锁状联合。经形态学初步鉴定为花脸香蘑，命名为HL-ND。

图1 采集的野生香蘑属真菌子实体Fig.1 Collected fruiting bodies of Lepista sp.

图2 花脸香蘑 HL-ND的菌落及菌丝形态Fig.2 Mycelium morphology and colony of L.sordida HL-ND

2.2 花脸香蘑的分子鉴定

从图3～4可知，HL-ND菌株的ITS序列和28S rDNA的D1D2区序列与花脸香蘑(Lepistasordida)的相关序列的相似率均高达99%，结合形态学指标鉴定其为花脸香蘑。

图3 HL-ND 菌株根据 ITS 序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree constructed from ITS sequences of HL-ND strain

图4 HL-ND 菌株根据28S rDNA D1D2区序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree constructed from sequences of 28S rDNA D1D2 region of HL-ND strain

2.3 花脸香蘑 HL-ND菌株的生物学特性

从图5可知，花脸香蘑在不同温度、pH、碳源、氮源及无机盐下的生长情况。

2.3.1 生长温度 随着温度的升高，花脸香蘑HL-ND菌丝生长速度逐渐加快，至25℃时，菌丝生长速度达到最大，为(3.507 7±0.060 5)mm/d。当温度超过25℃，菌丝生长速度极剧下降。当培养温度为35℃时，平板培养10 d，菌丝块仍没有萌发的迹象。故花脸香蘑HL-ND菌丝最佳生长温度为25℃。

2.3.2 pH 花脸香蘑HL-ND菌丝在pH 4.5～11均能生长，在pH 7.0～9.0的碱性环境下菌丝生长速度较快，其最适pH为8.0，当pH超过10.0菌丝生长速度迅速下降。

2.3.3 碳源 碳源是花脸香蘑最重要的营养物质，可为花脸香蘑的生长提供碳元素和能量，花脸香蘑能利用的碳源较广泛。无论是大分子的纤维素、淀粉，还是小分子的葡萄糖均能被菌丝吸收。但花脸香蘑HL-ND菌丝在不同碳源培养基上生长速度不同，其中，在葡萄糖和乳糖为碳源的培养基上生长速度最慢，在以糖蜜、红糖、蔗糖、纤维素、淀粉及玉米粉为碳源的培养基上菌丝生长速度比较接近，以糖蜜为碳源时菌丝生长最快，糖蜜为最佳碳源。

2.3.4 氮源 花脸香蘑HL-ND菌株可以利用多种有机氮源和无机氮源。无机氮源以硝酸钾的生长速率最快，氯化铵次之，硫酸铵最慢。有机氮源较易于被HL-ND菌株利用，其生长速率明显高于无机氮源，其中以土豆浸粉最佳。

图5 不同温度、pH、碳源、氮源及无机盐下花脸香蘑的菌丝生长量Fig.5 Growth of L.sordida with different temperature,pH,carbon source,nitrogen source and inorganic salt

2.3.5 无机盐 无机盐是食用菌菌丝的重要组成成份，很多无机盐是酶的激活剂，对菌丝的生长具有促进作用，但是也有一些无机盐对菌丝的生长具有抑制作用。培养基内添加不同的无机盐对花脸香蘑HL-ND菌丝的生长有不同的作用，硫酸亚铁为菌丝生长最佳无机盐，其对菌丝的生长具有明显的促进作用，而培养基内添加0.1%的硫酸钾、硫酸钠后，花脸香蘑菌丝生长明显受到抑制。其余无机盐的加入对花脸香蘑菌丝的生长没有明显的作用。

3 结论和讨论

研究分离的香蘑属真菌菌种经ITS、26S rDNA的D1、D2区序列测定，配合形态学特征鉴定为花脸香蘑，其菌落淡紫色，菌丝多分支，具锁状联合，常缠绕成束状或球状。菌种最佳生长温度为25℃，最佳生长pH 7.0～9.0，最佳碳源、氮源、无机盐分别为糖蜜、土豆浸粉和硫酸锌。

花脸香蘑具有气味香浓、味道鲜美、色泽宜人及营养丰富等特点，是一种珍稀的药食两用真菌，一直以来倍受食用菌爱好者青睐。但花脸香蘑野外资源稀少，不能满足人们的需要，故开展花脸香蘑人工栽培势在必行。本研究丰富了花脸香蘑的种质资源，研究了菌丝的生长条件和营养要求，可为今后的人工栽培提供参考。